Frontiers in Microbiology

Discussão

Os dados aqui apresentados são consistentes com um novo caminho para a redução de nitrato em organismos que não têm a clássica formação de NO (NirS ou NirK) ou formação de nitrito de amônia (NirB/NirA) com a cepa AmH de N. profundicola como um sistema modelo útil. Uma via de HURM inversa foi proposta onde o nitrito é reduzido a hidroxilamina no periplasma e subsequentemente reduzido a amônia no citoplasma (Campbell et al., 2009). A via original foi ligeiramente modificada aqui para incluir um candidato mais provável para o doador de elétrons proximal ao Har/Hcp, um 4Fe-4S previsto contendo proteína codificada por NAMH_1302 (Figura 1). Homólogos de NAMH_1302 são conservados em C. concisus (acesso GenBank YP_001466207), C. curvus (YP_001408944), C. fetus (YP_892678), e C. mediatlanticus (ZP_01871213) que possuem todos os outros genes para a via de HURM inversa. Além disso, NAMH_1302 mostrou um aumento na abundância de transcrição em células de N. profundicola cultivadas em nitrato em relação ao amônio.

Embora a produção de hidroxilamina a partir de nitrato e nitrito tanto por via química (Rollefson e Oldershaw, 1932) como por via biológica (Lindsey e Rhines, 1932) seja há muito conhecida e um complexo de 3 foi mostrado para reduzir nitrito a hidroxilamina quando fornecido com redutor (Kostera et al, 2010), a proporção de hidroxilamina vs. produção de amónio a partir de nitrito na via inversa ao HURM ainda não é clara. A absorção de hidroxilamina extracelular pelas bactérias é conhecida; a hidroxilamina fornecida exogenamente acumula-se rapidamente no anammoxossoma de Kuenenia stuttgartiensis (Lindsay et al., 2001; Schmidt et al., 2004), um compartimento que só pode ser alcançado atravessando tanto a célula como as membranas do anammoxossoma. A captação proposta da hidroxilamina altamente mutagênica requer proteção contra lesões de DNA, o que pode explicar parcialmente o extenso complemento de sistemas de reparo de DNA identificados em N. profundicola (Campbell et al., 2009). A hidroxilamina também tem sido proposta como um intermediário da produção de amônia a partir de nitrito em plantas e algas como ferredoxina-dependente de nitrito redutase apresenta alta reatividade e especificidade para este substrato (Kuznetsova et al., 2004; Hirasawa et al, 2010).

Não parecido com a função quinona redutase do HURM em oxidantes amoniacais (Klotz e Stein, 2008; Simon e Klotz, 2013), propomos que o HURM em N. profundicola actue, semelhante ao NrfAH, como um sistema peri-plasmático de quinol oxidase que transporta electrões da piscina de quinol para reduzir o nitrito a hidroxilamina. É provável que a via inversa-HURM evoluiu de um ancestral comum do NrfAH e ONR módulo de amonificação em bactérias anammox. Hipotamos que isto ocorreu antes do HURM – incluindo um complexo trimérico de HaoA covalentemente ligado capaz de desproporção de hidroxilamina – foi usado como módulo catabólico tanto em bactérias anaeróbias como aeróbias oxidantes de amônia (Jetten et al., 2009; Klotz e Stein, 2010; Campbell et al., 2011; Kern et al., 2011; Simon e Klotz, 2013). Uma reversão semelhante da função de redução da atividade oxidante para a atividade oxidante, efetuada pela formação covalente de complexos ósseos, foi discutida para o citocromo c’-beta redutor de NO (cytS) e o citocromo P460 oxidante de NO (cytL) (Elmore et al., 2007). Os genes que codificam os módulos NrfAH e HURM reverso coexistem em apenas uma sequência de genoma bacteriano, C. fetus 82-40 (Tabela 1). Foi mostrado recentemente que a octaheme citocromo c hidroxilamina desidrogenase evoluiu como um membro de uma superfamília de proteínas multiheme citocromo c com funções nos ciclos de nitrogênio e enxofre e que o citocromo cM552 (CycB), NrfH e NapC são membros de outra superfamília citocromo c (Bergmann et al., 2005; Klotz e Stein, 2008; Kern et al., 2011; Simon e Klotz, 2013). Sabe-se também que os complexos NAP em Epsilonproteobacteria geralmente não contêm proteínas da subunidade NapC (Klotz et al., 2006; Sievert et al., 2008; Kern e Simon, 2009; Klotz e Stein, 2010; Simon e Klotz, 2013). A função inversa proposta de um complexo n-cM552 (CycB/NapC) como um complexo nitrito redutase-quinol oxidase é viável dada a presença de ambas as transcrições e a ausência da proteína ligante crítica da tirosina em N. profundicola HaoA (Campbell et al, 2009), que separam o N-óxido redutor de NrfA e ONR do complexo N-óxido oxidante HAO (Bergmann et al., 2005; Klotz e Stein, 2008; Kern et al., 2011; Simon e Klotz, 2013).

Os dados de assimilação de 15N estabeleceram que o N. profundicola incorpora nitrato-nitrogênio na biomassa durante o crescimento quando é fornecido como a única fonte de nitrogênio. No entanto, o vasto excesso de produção de amônia a partir do nitrato sobre as demandas calculadas para biossíntese nos leva a concluir que a função primária da redução de nitrato para amônia por N. profundicola é a de um eficiente aceitador de elétrons respiratórios. Esta conclusão é suportada pelo aumento das taxas de crescimento e rendimentos em culturas de N. profundicola com nitrato como o único aceitador de electrões. Além disso, os dados de expressão gênica concordam com nossa proposta (Campbell et al., 2009) de que isso ocorre através da função concertada de Nap, HURM (3 e cM552) e Har/Hcp como um novo caminho de N-assimilação e conservação de energia: o caminho inverso do HURM. Finalmente, os dados indicam que N. profundicola tem a capacidade de reduzir rapidamente a hidroxilamina ao amônio, consistente com a proposta da hidroxilamina livre como intermediário na via de HURM reversa. A alta taxa de absorção de hidroxilamina observada provavelmente explica porque não é observada consistentemente durante o crescimento de culturas com nitrato. As medições preliminares da produção de amónio a partir de nitrato ou nitrito em células em repouso são semelhantes à taxa de 3 μM min-1 (108 células)-1 calculada a partir de culturas, ~10 vezes inferior à taxa de consumo de hidroxilamina observada. Dadas estas taxas, a hidroxilamina deve ser consumida imediatamente após a produção em culturas que crescem com nitrato. Uma vez que a hidroxilamina é mutagênica, colocamos a hipótese de que isto reflete a pressão seletiva anterior para manter baixos níveis de hidroxilamina durante o crescimento.

Embora a rotulagem da biomassa tenha sido tentada com 15N-NH2OH em culturas de N. profundicola em lote, ainda não foi bem sucedida (dados não mostrados). Dado que a hidroxilamina em culturas batch deve ser fornecida em baixas concentrações em relação ao nitrato não rotulado para evitar toxicidade e que a grande maioria do N da hidroxilamina deve ser convertida em amônia (>90% baseado na Figura 3), este resultado não é surpreendente. Experimentos de rotulagem a curto prazo com concentrações muito maiores de hidroxilamina rotulada como única fonte de N pode estabelecer definitivamente este ponto.

Em conclusão, os dados aqui apresentados são consistentes com um modelo onde o N. profundicola reduz o nitrato através de um intermediário livre de hidroxilamina. Estas experiências ainda não excluem completamente a possibilidade de que a actividade de HURM invertido proposta em N. profundicola funcione como uma nitrito redutase formadora de amónio que transfere 6 electrões sem libertar um intermediário de N-óxido. Resultados não publicados indicam que algumas mutações pontuais no gene nrfA podem tornar o citocromo pentaheme c nitrito redutase numa enzima que liberta intermediários de óxido N e não consegue converter estequiometricamente o nitrito em amónio (Jörg Simon, pers. communi.). Dada a relação evolutiva entre nrfA e haoA (Bergmann et al., 2005; Simon e Klotz, 2013), o módulo reverso-HURM em N. profundicola pode funcionar naturalmente como um complexo enzimático produtor de amónio e hidroxilamina, enquanto que o NrfA existente opera “sem fugas” como uma enzima produtora de nitrito redutase de amónio. Outras experiências usando inibidores de Har/Hcp com nitrato ou nitrito como substrato em células inteiras e/ou estudos bioquímicos do complexo HURM reverso para determinar o produto in vitro devem fornecer testes directos adicionais desta hipótese. Independentemente do mecanismo específico, a produção extensiva de amônia muito acima das necessidades biossintéticas por N. profundicola sugere que ela e as Epsilonproteobactérias relacionadas podem servir um papel ecológico como fonte de amônia em ambientes ricos em nitrato, privados de amônia e hipóxicos onde eles são comumente encontrados.

Materiais e Métodos

Cálculos de Energia Livre

Energia livre de Gibbs (Tabela 2) foram calculados a partir dos potenciais redox padrão das meias-reações pela equação de Nernst (Δ G0 = -nFE0) ou pela soma das meias energias livres de reação coletadas da literatura (Thauer et al, 1977; van der Star et al., 2008). Todos os cálculos foram realizados em condições padrão (1 M todas as espécies, 25°C, pH = 7).

Cultura e Análise de Compostos de Nitrogênio

N. A cepa profunda AmH (ATCC BAA-1463) foi cultivada e as células contadas como descrito anteriormente (Smith et al., 2008; Campbell et al., 2009). O amônio em sobrenadantes de cultura foi quantificado após derivatização com cloreto de dansyl e separação por HPLC com detecção de fluorescência (Shakila et al., 2001). O nitrato foi quantificado por HPLC usando a detecção UV/Vis. As concentrações de hidroxilamina foram determinadas em filtrados de cultura (0,2 μm) como descrito por Frear e Burrell (1955).

15N Procedimentos de Rotulagem

Soluções de estoque de 20 Atom% 15N-nitrato e 15N-amônio foram preparadas misturando >99 Atom% e sais de abundância natural para preparar o meio a uma concentração final de nitrato de 5 mM ou amônio, conforme necessário. As células foram colhidas de culturas com 15N rotulado por centrifugação e o pellet de células foi lavado três vezes com água nanopurada para remover os sais. A suspensão celular foi seca em cápsulas de estanho que foram enviadas para o laboratório de isótopos estáveis da Universidade da Califórnia-Davis, onde 15N Atom % foi determinado por espectrometria de massa de razão isotópica. As amostras de controlo indicaram que não tinha ocorrido contaminação isotópica durante o processamento da amostra (dados não apresentados).

PCR quantitativa

Primers específicos do género (Tabela 3) foram utilizados para quantificar a abundância de mRNA no RNA total extraído de N. profundicola, como descrito anteriormente (Campbell et al.., 2009).