Frontiers in Microbiology

Táblázat 1. A nitrogénanyagcsere-génleltárak a genom-szekvenált Epsilonproteobaktériumokban.

TÁBLA 2

N. profundicola növekedése nitráttal

A N. profundicola korábbi jellemzése és növekedése olyan közeget használt, amely poliszulfidot kombinált kénforrásként és elektronakceptorként tartalmazott (Campbell et al., 2001, 2009; Smith et al., 2008). A nitrátnak a N. profundicola energiaanyagcseréjében betöltött szerepének további tisztázása érdekében az AmH törzset szulfiddal mint egyedüli kénforrással termesztettük, így a nitrát volt az egyedüli elektronakceptor (2. ábra). Az elektrondonor hidrogén és formiát keveréke volt olyan közegben, amelyben nem volt más kén- vagy nitrogénforrás (Campbell és mtsai., 2001). A nitrátot potenciális elektronakceptorként és nitrogénforrásként, valamint szulfidot (kénforrás) vagy poliszulfidot (kénforrás és potenciális elektronakceptor) tartalmazó táptalajon a növekedési sebesség több mint kétszerese volt az ammóniumot egyedüli nitrogénforrásként és poliszulfidot elektronakceptorként és kénforrásként használó kultúrákban megfigyelt növekedési sebességnek. A várakozásoknak megfelelően az ammóniummal mint nitrogénforrással és szulfiddal mint kénforrással ellátott negatív kontroll (elektronakceptor nélküli) kultúrák nem tudtak növekedni.

Nitrogénegyensúly a N. profundicola kultúrákban

Az N. profundicola által termelt ammónium szintjének a bioszintetikus szükségletet meghaladó voltának megerősítésére a bioszintetikus nitrogénigényt a következőképpen számoltuk ki. Feltételezve, hogy az exponenciálisan növekvő bakterioplankton C:N aránya 32:6,4 (Vrede et al., 2002), 288 fg C μm-3 az exponenciálisan növekvő Escherichia coli esetében (Loferer-Krossbacher et al., 1998), és a N. profundicola jelentett méreteiből számított 0,021 μm3 sejttérfogat (Smith et al., 2008), 1 × 108 sejt ml-1 termelése ~120 ng ml-1 N-t igényel (~9 μM), ami a felhasznált N-forrástól függetlenül nem változik. A N. profundicola nem hasznosította a poliszulfiddal mint elektronakceptorral történő növekedés során biztosított ammónium jelentős részét (3. ábra, nyitott körök), ami összhangban van a megfigyelt sejtsűrűségek előállításához számított alacsony N-szükséglettel. Az ammónium plusz szulfid kultúra nem növekedett (2. ábra), és nem is fogyasztott kimutathatóan ammóniumot (3. ábra, zárt körök). Ezzel szemben az 5 mM nitráton nevelt sejtek által termelt ammónium mennyisége poliszulfiddal 4,6 mM, szulfiddal 5,2 mM volt (3. ábra, nyitott és zárt négyzetek). Ha az Epsilonproteobaktériumokban a fordított HURM-útvonal elsősorban a bioszintézishez szükséges ammónium előállítására szolgál, akkor azt várnánk, hogy az alacsony exogén ammóniumszintek erősen elnyomják a HURM-útvonal génexpresszióját és a nitrátredukciós aktivitást. Azonban a nitrátnak a megjósolt N-szükségletet meghaladó sztöchiometrikus átalakulása ammóniává és az ammónium + poliszulfid kultúrákban megfigyelt ammóniumfogyasztás összhangban van azzal a hipotézissel, hogy a nitrátot terminális elektronakceptorként használja a N. profundicola, és a nitrátammonifikációt nem nyomja el az ammónium.

15N-NO-3 beépülése a biomasszába

A nitrátasszimilációs potenciált úgy értékeltük, hogy vizsgáltuk a 15N-jelölt ammónium vagy nitrát beépülését a N. profundicola biomasszába az elektrondonorok és potenciális akceptorok minden fenti kombinációjával történő növekedés során. A 20 Atom% 15N-jelölt ammóniummal és poliszulfiddal növesztett N. profundicola egy szakaszos tenyésztési kör után ~10 Atom% 15N-ra feldúsult biomasszát termelt (4. ábra), míg a jelöletlen kontroll nem volt 15N-ban feldúsulva. A szulfiddal és 20 Atom% 15N-jelölt nitráttal termesztett kultúrák 16 Atom% 15N-ra dúsított biomasszát eredményeztek (4. ábra). A nitráton termesztett biomassza körülbelül 5-ször több N-t tartalmazott, mint az ammóniumon termesztett biomassza (az adatok nem láthatóak), ami megmagyarázhatja a nitráton termesztett mintákban a 15N nagyobb mértékű feldúsulását.

A kulcsfontosságú útvonal génjeinek átírása

A N. profundicola javasolt reverz-HURM útvonalának enzimjeit kódoló gének átírási mennyiségét mennyiségi valós idejű PCR segítségével határoztuk meg ammóniummal vagy nitráttal termesztett szakaszos kultúrákban. A javasolt útvonal minden komponense erősen megnövekedett transzkriptbőséget mutatott a nitrátos tenyészetekben (5. ábra). A nitrát-reduktáz alegységet (napA) kódoló mRNS-ek 4,6-szor (P < 0,05, kétfarkú heteroszkedasztikus t-próba) nagyobb mennyiségben voltak jelen a nitrát + szulfiddal tenyésztett sejtekben az ammónium + poliszulfiddal tenyésztett sejtekhez képest. A HURM mindkét komponensének, a haoA és a cycB/napC transzkriptje 8,5-, illetve 7,1-szeresére nőtt (P < 0,05 mindkét esetben). Összhangban azzal az előrejelzésünkkel, hogy a HURM által a periplazmában termelt hidroxilamint a fő facilitátor fehérje csatornákon keresztül szállítják, az ammónium/metil-ammónium transzporter amtB mindkét homológját kódoló mRNS-ek 4,5-szeresére (amtB-1, NAMH_0397, P < 0,08) és 10,3-szorosára (amtB-2, NAMH_0215, P > 0,10) nőttek. A hidroxilamin erős mutagén, amelyet a citoplazmába jutva detoxifikálni kell. Azt javasoljuk, hogy ezt a NADH-függő Har/Hcp végzi, a Rhodobacter capsulatus E1F1 nitrátasszimilációs génklaszterében található hcp gén vizsgálatai alapján, ahol a citoplazmatikus asszimilációs nitrátreduktáz által termelt hidroxilamin redukciójához és asszimilációjához szükséges (Cabello és mtsai., 2004; Pino és mtsai., 2006). Ezzel a javaslattal összhangban a legnagyobb transzkriptabőség-változást a har esetében tapasztaltuk, amely 11,7-szeresére nőtt, de ez a változás nem volt szignifikáns (P > 0,10) a har transzkriptabőség független méréseinek nagyfokú változékonysága miatt. Eredetileg azt javasoltuk, hogy a har elektrondonorja egy NADH-dehidrogenáz, amelyet a NAMH_0542 kódol (Campbell et al., 2009). Most azonban úgy gondoljuk, hogy más Epsilonproteobaktériumokban való konzerváltság alapján jobb jelölt erre a funkcióra a NAMH_1302, egy előre jelzett 4Fe-4S klaszterfehérje (1. táblázat). Ezzel a predikcióval összhangban a NAMH_1302 transzkriptumai 4,6-szor nagyobb mennyiségben fordultak elő nitrátos sejtekben az ammóniumhoz képest, de a változás nem volt szignifikáns (P > 0,10).

Az útvonal expressziójának esetleges ammónium-repressziójának vizsgálatához ammóniumot adtunk nitrát + szulfiddal növesztett kultúrákhoz, és ugyanezen gének mRNS-mennyiségét számszerűsítettük. Általánosságban elmondható, hogy az ammónium hozzáadása 1,2- és 3,6-szeresére csökkentette a reverz HURM-útvonalat kódoló gének mRNS-bőségét (5. ábra, szürke sávok), bár ez a hatás csak a HURM alegységeket kódoló haoA és napC/cycB transzkriptumok esetében volt szignifikáns (P < 0,10). Érdekes módon a napA expressziója csökkent a legkevésbé (1,2-szeresére), ami a nitrátlégzés szükségességét jelzi ezekben a sejtekben. Az ammónium hozzáadása egyetlen esetben sem csökkentette a transzkriptumok szintjét az ammónium + poliszulfidban nevelt kultúrákban tapasztalt szintre.

bizonyíték egy hidroxilamin intermedierre

A hidroxilamin közvetlen mérései nitráttal nevelt N. profundicola kultúrák szűrletében alacsony, de következetesen kimutatható hidroxilamin-szintet találtak (5,7 ± 3,5 μM, SD, n = 3). Ez az alacsony szint összhangban van egy olyan köztitermékkel, amelynek termelési és fogyasztási sebessége szorosan illeszkedik egymáshoz.

Az N. profundicola által metabolizálható-e a hidroxilamin, nitrátban nevelt sejtek mosott szuszpenzióit nitrátmentes táptalajban inkubáltuk, ahol a hidrogén volt az egyetlen elektrondonor. Potenciális elektronakceptorként hidroxilamint adtunk hozzá, és mind a hidroxilamin, mind az ammónium koncentrációját idővel követtük. A kísérlet eredményei azt mutatják, hogy a N. profundicola nitrátban nevelt sejtjei a hidroxilamint gyorsan és teljesen átalakítják ammóniává (6. ábra). A hidroxilamin átalakulásának fajlagos sebessége ebben a kísérletben 28,6 μM min-1 108 sejt-1 volt. A 3. ábrán látható exponenciális növekedésre (8-24 óra) számított nitrátból történő ammóniumtermelés sebessége ~3 μM min-1 (108 sejt)-1. Így a mért hidroxil-amin konverziós ráta messze meghaladja a N. profundicola nitráttal történő növekedése során megfigyelt ammóniumtermelés mértékét. Hasonlóan szoros kapcsolatról számoltak be a hidroxil-amin termelés és eltávolítás között a közelmúltban a kemolitotróf ammónia-oxidáló archeon, a Nitrosopumilus maritimus esetében, ahol a hidroxil-amin oxidáció egy lényeges katabolikus lépés (Vajrala et al., 2013).

Diszkusszió

Az itt bemutatott adatok összhangban vannak a nitrátredukció egy új útvonalával olyan szervezetekben, amelyekből hiányoznak a klasszikus NO-képző (NirS vagy NirK) vagy ammóniumképző (NirB/NirA) nitritreduktázok, a N. profundicola törzs AmH mint hasznos modellrendszer. Egy fordított HURM útvonalat javasoltak, amelynek során a nitrit a periplazmában hidroxilaminná redukálódik, majd a citoplazmában ammóniumra redukálódik (Campbell és mtsai., 2009). Az eredeti útvonalat itt kissé módosítottuk, hogy a Har/Hcp proximális elektrondonorának egy valószínűbb jelöltjét, a NAMH_1302 által kódolt, 4Fe-4S-t tartalmazó fehérjét (1. ábra) bevegyük. A NAMH_1302 homológjai konzerválódtak a C. concisusban (GenBank hozzáférés: YP_001466207), a C. curvusban (YP_001408944), a C. fetusban (YP_892678) és a C. mediatlanticusban (ZP_01871213), amelyek rendelkeznek a reverz-HURM útvonal minden más génjével. Ezen kívül a NAMH_1302 transzkriptumbőség növekedést mutatott a nitráton termesztett N. profundicola sejtekben az ammóniumhoz képest.

Míg a hidroxilamin előállítása nitrátból és nitritből mind kémiai (Rollefson és Oldershaw, 1932), mind biológiai úton (Lindsey és Rhines, 1932) régóta ismert, és egy 3 komplexről kimutatták, hogy redukálószerrel ellátva a nitritet hidroxilaminná redukálja (Kostera et al., 2010), a hidroxilamin vs. nitritből történő ammóniumtermelés aránya a fordított HURM-útvonalban még nem tisztázott. Az extracelluláris hidroxilamin baktériumok általi felvétele ismert; az exogén módon adagolt hidroxilamin könnyen felhalmozódik a Kuenenia stuttgartiensis anammoxoszómájában (Lindsay et al., 2001; Schmidt et al., 2004), amely kompartment csak a sejt- és az anammoxoszómamembránon való átjutással érhető el. Az erősen mutagén hidroxilamin javasolt felvétele szükségessé teszi a DNS-léziók elleni védelmet, ami részben magyarázatot adhat a N. profundicola-ban azonosított DNS-javító rendszerek kiterjedt komplementerére (Campbell és mtsai., 2009). A hidroxil-amint a növényekben és algákban a nitritből történő ammóniumtermelés intermedierjeként is javasolták, mivel a ferredoxin-függő nitrit-reduktáz nagy reaktivitást és specificitást mutat erre a szubsztrátra (Kuznetsova et al., 2004; Hirasawa et al., 2010).

A HURM ammónia-oxidálókban lévő kinon-reduktáz funkciójától eltérően (Klotz és Stein, 2008; Simon és Klotz, 2013), azt javasoljuk, hogy a HURM a N. profundicolában az NrfAH-hoz hasonlóan periplazmatikus kinol-oxidáz rendszerként működik, amely elektronokat szállít a kinol-poolból a nitrit hidroxilaminná történő redukciójához. Valószínű, hogy a fordított HURM-útvonal az NrfAH és az ONR ammonifikációs modul közös őséből fejlődött ki az anammox baktériumokban. Feltételezésünk szerint ez még azelőtt történt, hogy a HURM – beleértve egy kovalensen kötött trimer HaoA komplexet, amely képes a hidroxilamin disproporciójára – katabolikus modulként működött volna mind az anaerob, mind az aerob ammónia-oxidáló baktériumokban (Jetten és mtsai., 2009; Klotz és Stein, 2010; Campbell és mtsai., 2011; Kern és mtsai., 2011; Simon és Klotz, 2013). Az NO-redukáló citokróm c’-béta (cytS) és az NO-oxidáló citokróm P460 (cytL) esetében is hasonló, kovalens kötésvezérelt komplexképzéssel megvalósuló funkcióváltást tárgyaltak a redukáló aktivitásról az oxidálóra (Elmore és mtsai., 2007). Az NrfAH és a reverz-HURM modulokat kódoló gének csak egyetlen bakteriális genomszekvenciában, a C. fetus 82-40-ben léteznek együtt (1. táblázat). A közelmúltban kimutatták, hogy az oktahem citokróm c hidroxilamin-dehidrogenáz egy többhemes citokróm c fehérje szupercsalád tagjaként fejlődött ki, amelynek funkciói a nitrogén- és kénciklusban vannak, és hogy a citokróm cM552 (CycB), NrfH és NapC egy másik citokróm c szupercsalád tagjai (Bergmann et al., 2005; Klotz és Stein, 2008; Kern et al., 2011; Simon és Klotz, 2013). Az is ismert, hogy az Epsilonproteobaktériumok NAP-komplexei általában nem tartalmaznak NapC alegység fehérjéket (Klotz és mtsai., 2006; Sievert és mtsai., 2008; Kern és Simon, 2009; Klotz és Stein, 2010; Simon és Klotz, 2013). Az n-cM552 (CycB/NapC) komplex javasolt fordított funkciója nitrit-reduktáz-kinol-oxidáz komplexként megvalósítható, tekintettel mindkét transzkriptum jelenlétére és a N. profundicola HaoA kritikus tirozin fehérje ligandumának hiányára (Campbell et al., 2009), amelyek elválasztják az N-oxid redukáló NrfA és ONR komplexeket az N-oxid oxidáló HAO komplexektől (Bergmann és mtsai., 2005; Klotz és Stein, 2008; Kern és mtsai., 2011; Simon és Klotz, 2013).

A 15N asszimilációs adatok megállapították, hogy a N. profundicola a növekedés során nitrát-nitrogént épít be a biomasszába, ha azt egyedüli nitrogénforrásként biztosítják. Ugyanakkor a nitrátból származó ammóniumnak a bioszintézis számított igényeit meghaladó hatalmas többlettermelése arra enged következtetni, hogy a nitrát ammóniumra történő redukciójának elsődleges funkciója a N. profundicola számára a hatékony légzési elektronakceptor funkciója. Ezt a következtetést alátámasztja a nitrátot egyedüli elektronakceptorként használó N. profundicola-kultúrák megnövekedett növekedési rátája és hozama. Továbbá a génexpressziós adatok megegyeznek azzal a javaslatunkkal (Campbell et al., 2009), hogy ez a Nap, a HURM (3 és cM552) és a Har/Hcp összehangolt működésén keresztül történik, mint egy új N-asszimilációs és energiatakarékossági útvonal: a fordított HURM útvonal. Végül az adatok azt mutatják, hogy a N. profundicola képes a hidroxilamint gyorsan ammóniumra redukálni, ami összhangban van a szabad hidroxilaminra mint a fordított-HURM útvonal köztes termékére vonatkozó javaslattal. A hidroxilamin felvételének megfigyelt magas sebessége valószínűleg megmagyarázza, hogy miért nem figyelhető meg következetesen a nitráton történő tenyészetek növekedése során. A nyugalmi sejtekben nitrátból vagy nitritből történő ammóniumtermelés előzetes mérései hasonlóak a tenyészetekből számított 3 μM min-1 (108 sejt)-1 sebességhez, ami ~10-szer alacsonyabb, mint a megfigyelt hidroxilamin-fogyasztási sebesség. Ezeket az arányokat figyelembe véve a hidroxilaminnak a nitráton növő tenyészetekben a termelés után azonnal el kell fogynia. Mivel a hidroxilamin mutagén, feltételezzük, hogy ez azt a korábbi szelekciós nyomást tükrözi, hogy a növekedés során alacsony hidroxilamin-szintet tartsanak fenn.

Míg a biomassza 15N-NH2OH-val történő jelölését megkísérelték N. profundicola tételes tenyészetekben, ez még nem volt sikeres (az adatok nem láthatóak). Tekintettel arra, hogy a hidroxilamint a tételes tenyészetben a toxicitás elkerülése érdekében a nem jelölt nitráthoz képest alacsony koncentrációban kell adagolni, és hogy a hidroxilaminból származó N túlnyomó többségének ammóniává kell átalakulnia (>90% a 3. ábra alapján), ez az eredmény nem meglepő. Rövid távú címkézési kísérletek sokkal nagyobb koncentrációjú címkézett hidroxilaminnal mint egyedüli N-forrással véglegesen megállapíthatják ezt a pontot.

Végeredményben az itt bemutatott adatok összhangban vannak egy olyan modellel, amelyben a N. profundicola a nitrátot egy szabad hidroxilamin intermedier segítségével redukálja. Ezek a kísérletek még nem zárják ki teljesen annak lehetőségét, hogy a N. profundicolában javasolt reverz-HURM aktivitás egy ammóniumképző nitrit reduktázként működik, amely 6 elektront ad át N-oxid intermedier felszabadítása nélkül. Nem publikált eredmények azt mutatják, hogy az nrfA gén néhány pontmutációja a pentahem citokróm c nitrit reduktázt egy szivárgó enzimmé teheti, amely N-oxid intermediereket szabadít fel, és nem alakítja át a nitritet sztöchiometrikusan ammóniumra (Jörg Simon, pers. communi.). Tekintettel az nrfA és a haoA közötti evolúciós kapcsolatra (Bergmann és mtsai., 2005; Simon és Klotz, 2013), a N. profundicola fordított HURM modulja természetes módon ammóniumot és hidroxilamint termelő enzimkomplexként működhet, míg az extant NrfA “szivárgásmentesen”, ammóniumot termelő nitritreduktázként működik. A Har/Hcp nitrátot vagy nitritet mint szubsztrátot tartalmazó inhibitorokkal végzett további kísérletek egész sejtekben és/vagy a fordított-HURM komplex biokémiai vizsgálatai az in vitro termék meghatározására további közvetlen teszteket fognak biztosítani erre a hipotézisre. Függetlenül a konkrét mechanizmustól, a N. profundicola bioszintetikus szükségleteit messze meghaladó mértékű ammóniumtermelése arra utal, hogy ez és a rokon Epsilonproteobaktériumok ökológiai szerepet tölthetnek be ammóniumforrásként a nitrátban gazdag, ammóniumhiányos, hipoxiás környezetben, ahol gyakran előfordulnak.

Anyagok és módszerek

Szabadenergia-számítások

A Gibbs-féle szabad energiákat (2. táblázat) a félreakciók standard redoxpotenciáljaiból a Nernst-egyenlet (Δ G0 = -nFE0) vagy az irodalomból gyűjtött félreakciós szabad energiák összegzésével számoltuk (Thauer et al, 1977; van der Star et al., 2008). Minden számítást standard körülmények között végeztünk (1 M minden faj, 25°C, pH = 7).

Kultiválás és nitrogénvegyületek elemzése

A N. profundicola törzs AmH (ATCC BAA-1463) tenyésztése és a sejtek számolása a korábban leírtak szerint történt (Smith et al., 2008; Campbell et al., 2009). A tenyésztési felülúszókban lévő ammóniumot danzil-kloriddal történő deriválás és fluoreszcens detektálással ellátott HPLC-vel történő elválasztás után számszerűsítettük (Shakila és mtsai., 2001). A nitrát mennyiségi meghatározása HPLC-vel történt UV/Vis detektálással. A hidroxilamin-koncentrációkat a tenyésztési szűrletekben (0,2 μm) határoztuk meg Frear és Burrell (1955) leírása szerint.

15N jelölési eljárások

A 20 Atom%-os 15N-nitrát és 15N-ammónium törzsoldatokat >99 Atom%-os és természetes bőségű sók keverésével készítettük el, hogy szükség szerint 5 mM nitrát vagy ammónium végkoncentrációjú táptalajt készítsünk. A 15N-jelölt tenyészetekből a sejteket centrifugálással szedtük ki, és a sejtpelletet háromszor mostuk át nanotiszta vízzel a sók eltávolítása érdekében. A sejtszuszpenziót ónkapszulákban szárítottuk, amelyeket a University of California-Davis stabil izotóp laboratóriumába küldtünk, ahol izotóparányos tömegspektrometriával határoztuk meg a 15N atom%-ot. A kontrollminták azt mutatták, hogy a minta feldolgozása során nem történt izotópszennyeződés (az adatok nem láthatóak).

Kvantitatív PCR

Génspecifikus primereket (3. táblázat) használtunk a N. profundicolából kivont teljes RNS mRNS mennyiségének számszerűsítésére a korábban leírtak szerint (Campbell et al, 2009).

Hidroxilamin felvétel

A N. profundicola-t H2 és formiát mint elektrondonorokon és nitráton mint egyedüli elektronakceptoron növesztettük a késői exponenciális fázisig. A sejteket centrifugálással szedtük le. Minden transzfert és sejtmosást a Coy Laboratories anaerob kamrájában végeztünk. A sejteket nitrátmentes táptalajjal reszuszpendáltuk ~109 sejt ml-1 végkoncentrációig, és 45°C-on inkubáltuk 2 órán át 80% H2 + 20% CO2 atmoszférában, mielőtt anaerob módon készített törzsoldatból hidroxilamint (5 mM végkoncentráció) adtunk hozzá. A sejtszuszpenzió aliquotjait megszűrtük, és a fent leírtak szerint vizsgáltuk hidroxilaminra, valamint dietil-etoxi-metilén-emalonáttal történő deriválás után HPLC-vel ammóniumra (Gómez-Alonso et al, 2007).

Autor Contributions

Thomas E. Hanson, Barbara J. Campbell és Martin G. Klotz közösen tervezték meg a kísérleteket és értelmezték az eredményeket, Thomas E. Hanson végezte az összes nitrogénvegyület-elemzést és készítette elő a mintákat a tömegspektrometriához, Barbara J. Campbell tenyésztette az összes kultúrát és végezte a mennyiségi PCR-t, Katie M. Kalis végezte a hidroxilamin-felvételi kísérleteket, Mark A. Campbell azonosította a NAMH_1302-t mint releváns gént. Thomas E. Hanson fogalmazta meg a cikket, amelyet ezt követően Thomas E. Hanson, Barbara J. Campbell és Martin G. Klotz átdolgozott.

Enyilatkozat az érdekellentétről

A szerzők kijelentik, hogy a kutatást olyan kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolatok hiányában végezték, amelyek potenciális érdekellentétként értelmezhetők.

Köszönet

A szerzők köszönetet mondanak Lisa Y. Stein (Univ. Alberta-Edmonton), Jenn Macalady (Penn State Univ.), David Kirchman és Matt Cottrell (Univ. Delaware) a kéziratvázlatok kritikus olvasásáért, Jennifer Biddle-nek az anaerob kamrához való hozzáférésért és Kathy Coyne-nak a HPLC-hez való hozzáférésért. Ezt a projektet a Nemzeti Tudományos Alapítvány Barbara J. Campbell és S. Craig Cary (EF-0333203), Barbara J. Campbell (DEB-0640414), Barbara J. Campbell és Thomas E. Hanson (MCB-0950691), valamint Martin G. Klotznak (MCB-0948202/1202648), a Delaware-i Egyetemnek nyújtott EPSCoR RII-2 támogatásból (EPS-0814251), valamint az Észak-Karolinai Egyetem által Martin G. Klotznak nyújtott ösztönző pénzeszközökből.