Polymeraskedjereaktion (PCR) är en teknik som använder DNA-polymeras för att amplifiera en enskild DNA-sträng eller ett DNA-segment. Med en slutprodukt som varierar från tusentals till miljontals DNA-kopior är PCR en extremt viktig del av medicinsk och klinisk forskning. Utvecklarna, Kary Mullis och Michael Smith, fick Nobelpriset i kemi för sitt bidrag.
DNA-syntes genom PCR har använts för flera tillämpningar i senare led:
- DNA-isolering: Denna teknik gör det möjligt att separera och studera specifika DNA-segment, t.ex. vid DNA-sekvensering eller genetiska fingeravtryck.
- Amplifiering: Kanske den vanligaste användningen: PCR kan användas på de minsta insamlade mängder DNA för att öka mängden och storleken på proverna. Detta är ovärderligt vid kriminaltekniska undersökningar eller historiska DNA-analyser.
- Medicinska användningsområden: Tekniken används på sjukhus för prenatala tester, genetisk kartläggning, cancerscreening, vävnadstypning och precisionsterapi vid sjukdomsbehandling.
- Bakterie- och virussjukdomar: Genom att testa specifikt DNA kan vissa infektionssjukdomar upptäckas uteslutande genom PCR. Vävnader kan också analyseras för genuttryck, vilket testar specifika sjukdomar.
Metodik och process
Samtidigt som det finns olika metoder som används beroende på det specifika syftet med DNA, finns det en generaliserad mall för PCR. På grund av känsligheten för DNA-kontaminering följer tekniken ett noggrant protokoll för att förbli ren.
- Initialisering: Vid användning av PCR med varmstart, som är användbar vid amplifiering av specifika typer av DNA, värms reaktionskammaren först upp till cirka 200o F i flera minuter.
- Denaturering: I vanliga tekniker består detta av att temperaturen höjs i flera sekunder till cirka 200o F för att denaturera DNA-strängarna genom att bryta vätebindningar. Detta resulterar i två separata DNA-strängar som är redo att fästas vid nya primers.
- Glödgning: Temperaturen sänks men hålls fortfarande över smältpunkten för att underlätta mycket specifik bindning. Detta gör det möjligt för primers att fästa vid komplementära enskilda DNA-strängar. Dubbelhelixen är redo att bildas igen.
- Förlängning: I detta skede syntetiserar DNA-polymeraset en helt ny sträng genom att förlänga de redan tillgängliga primers som bildats under glödgningsprocessen. Med hjälp av dNTP-fosfatgrupper förlängs strängen. Antalet DNA-sekvenser bör fördubblas. När dNTP och DNA-polymeras förbrukas uppstår ett utjämningssteg tills det når en platå där alla reagenser och enzymer är uttömda. Exakt kvantifiering av PCR-produkter kan vara otillförlitlig på grund av olika platåstadier. Skapandet av varje produkt betraktas som en cykel. Nytt DNA skapas exponentiellt i flera förlängningscykler.
- Slutlig förlängning: Även om detta steg inte är nödvändigt är det användbart för att säkerställa att eventuella återstående strängar förlängs.
- Final Hold: Temperaturen kyls ned till cirka 40o F för att de nysyntetiserade DNA-strängarna ska kunna stelna helt och förberedas för lagring.
Den roll som dNTP spelar
Det finns fyra typer av dNTP, eller deoxynukleotidtrifosfat, där var och en använder en annan DNA-bas: adenin (dATP), cytosin (dCTP), guanin (dGTP) och tymin (dTTP). Genom att använda dNTP under förlängningsfasen tillhandahålls enkla baser som är redo att gå in i DNA och fördubbla det, som byggstenar.
Då syftet med tekniken är att syntetisera nytt DNA, tillhandahåller dNTP nukleotider till den ”upprivna” strängen med hjälp av mallen för en enkel sida. Detta förvandlar en enkel DNA-sträng till två, och kan fortsätta exponentiellt så länge reagenserna förblir närvarande fram till det sista hållsteget.
BioChains dNTP-mixprodukter
De dNTP-produkter och -blandningar som tillhandahålls av BioChain är specialtillverkade och testade för molekylärbiologiska tillämpningar. De kan användas i PCR, RT-PCR, DNA-märkning och DNA-sekvenseringsprocesser. DNTPs renas med preparativ HPLC och har en renhet på minst 99,5 %.
Rigorösa kontrollstandarder och toppmodern teknik säkerställer bästa produktkvalitet. Koncentrationen verifieras genom spektrofotometri med optisk densitet. Beredningen är noggrann för att undvika DNas- och RNaskontaminering. Detta bestäms genom inkubation av kvaliteten med radioaktiva substrat.
Varje parti dNTP testas också för prestanda med Taq/Pfu/T7 DNA-polymeras och Sequenase. Vidare har dNTP testats i BioChains laboratorium på plats genom lång PCR för att amplifiera 15 kb (E. coli DNA-mall) och 30 kb (Lambda DNA-mall).
Individuellt separerade basnukleotidblandningar finns tillgängliga tillsammans med Hotstart Taq DNA-polymeras-reagens för alla PCR-behov.
BioChain erbjuder det mest konkurrenskraftiga priset på marknaden. Rabatt vid inköp av stora mängder/volym är tillgänglig.
Finn fler dNTP-produkter här!