Polymerázová řetězová reakce (PCR) je technika, která využívá DNA polymerázu k amplifikaci jednoho vlákna nebo úseku DNA. Vzhledem k tomu, že výsledný produkt se pohybuje v rozmezí tisíců až milionů kopií DNA, je PCR mimořádně důležitou součástí lékařského a klinického výzkumu. Její vývojáři, Kary Mullis a Michael Smith, získali za svůj přínos Nobelovu cenu za chemii.
Syntéza DNA pomocí PCR se používá pro několik navazujících aplikací:
- Izolace DNA: Tato technika umožňuje oddělit a studovat specifické segmenty DNA, například v případech sekvenování DNA nebo genetického určování otisků prstů.
- Amplifikace: Snad nejběžnější použití, PCR lze použít na nejmenší množství odebrané DNA, aby se zvětšilo množství a velikost vzorků. To je neocenitelné při forenzní nebo historické analýze DNA.
- Použití ve zdravotnictví: V případě potřeby je možné použít PCR v lékařství: Tato technika se používá v nemocnicích pro prenatální testování, genetické mapování, screening rakoviny, typizaci tkání a přesnou terapii při léčbě nemocí.
- Bakteriální/virová onemocnění: Testováním specifické DNA lze zjistit některá infekční onemocnění výhradně pomocí PCR. Tkáně lze také analyzovat na expresi genů a testovat tak specifické nemoci.
Metodika a proces
Ačkoli se používají různé metody v závislosti na konkrétním účelu DNA, existuje obecná šablona pro PCR. Vzhledem k citlivosti na kontaminaci DNA se tato technika řídí pečlivým protokolem, aby zůstala čistá.
- Inicializace: Při použití PCR s horkým startem, která je užitečná při amplifikaci specifických druhů DNA, se reakční komora nejprve zahřeje na teplotu přibližně 200o F po dobu několika minut.
- Denaturace: U běžných technik spočívá ve zvýšení teploty na několik sekund na přibližně 200o F, aby došlo k denaturaci vláken DNA přerušením vodíkových vazeb. Výsledkem jsou dvě oddělená vlákna DNA, která jsou připravena k připojení nových primerů.
- Žíhání: Teplota se sníží, ale stále se udržuje nad bodem tání, aby se usnadnilo velmi specifické navázání. To umožňuje, aby se primery připojily ke komplementárním jednotlivým vláknům DNA. Dvojitá šroubovice je opět připravena k vytvoření.
- Prodloužení: V této fázi DNA polymeráza syntetizuje zcela nové vlákno prodloužením již dostupných primerů vytvořených během kroku žíhání. Pomocí fosfátových skupin dNTP dochází k prodloužení vlákna. Počet sekvencí DNA by se měl zdvojnásobit. Jak se dNTP a DNA polymeráza spotřebovávají, dochází k vyrovnávací fázi, dokud se nedosáhne plató, v němž jsou všechna činidla a enzymy vyčerpány. Přesná kvantifikace produktů PCR může být nespolehlivá kvůli různým fázím plateau. Konečné vytvoření každého produktu se považuje za jeden cyklus. Nová DNA se vytváří exponenciálně v několika prodlužovacích cyklech.
- Konečná elongace: Ačkoli tento krok není nezbytný, je užitečný, aby se zajistilo prodloužení všech zbývajících vláken.
- Závěrečné podržení: Teplota se ochladí na přibližně 40o F, aby se nově syntetizovaná vlákna DNA plně ustálila a byla připravena ke skladování.
Úloha dNTP
Existují čtyři typy dNTP neboli deoxynukleotidtrifosfátu, přičemž každý využívá jinou bázi DNA: adenin (dATP), cytosin (dCTP), guanin (dGTP) a tymin (dTTP). Použití dNTP během prodlužovací fáze poskytuje jednotlivé báze připravené přejít do DNA a zdvojit ji, jako stavební kameny.
Protože účelem této techniky je syntetizovat novou DNA, dNTP poskytuje nukleotidy „rozbalenému“ vláknu pomocí šablony z jedné strany. Tím se jedno vlákno DNA změní na dvě a může exponenciálně pokračovat, dokud jsou přítomna činidla až do konečné fáze podržení.
Produkty dNTP směsí společnosti BioChain
Produkty a směsi dNTP poskytované společností BioChain jsou speciálně vyráběny a testovány pro aplikace v molekulární biologii. Lze je použít v procesech PCR, RT-PCR, značení DNA a sekvenování DNA. DNTP jsou čištěny pomocí preparativní HPLC a mají nejméně 99,5% čistotu.
Přísné kontrolní standardy a nejmodernější technologie zajišťují nejlepší kvalitu produktů. Koncentrace se ověřuje pomocí spektrofotometrie optické hustoty. Při přípravě se dbá na to, aby nedošlo ke kontaminaci DNázou a RNázou. Ta se zjišťuje inkubací kvality s radioaktivními substráty.
Každá šarže dNTP je také testována na výkon s Taq/Pfu/T7 DNA polymerázou a sekvenázou. Dále byl dNTP testován na výkonnost v laboratoři společnosti BioChain na místě pomocí dlouhé PCR pro amplifikaci 15 kb (templát DNA E. coli) a 30 kb (templát DNA Lambda).
K dispozici jsou individuálně oddělené směsi bázových nukleotidů spolu s činidly Hotstart Taq DNA polymerázy pro všechny potřeby PCR.
BioChain nabízí nejkonkurenceschopnější cenu na trhu. Při odběru velkého množství je k dispozici sleva.
Najdete zde další dNTP produkty!