Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein Verfahren, bei dem die DNA-Polymerase zur Vervielfältigung eines einzelnen DNA-Strangs oder -Segments verwendet wird. Da das Endprodukt zwischen Tausenden und Millionen von DNA-Kopien liegt, ist die PCR ein äußerst wichtiger Bestandteil der medizinischen und klinischen Forschung. Die Entwickler, Kary Mullis und Michael Smith, wurden für ihren Beitrag mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet.
Die DNA-Synthese durch PCR wurde für verschiedene nachgeschaltete Anwendungen genutzt:
- DNA-Isolierung: Mit dieser Technik können bestimmte DNA-Segmente abgetrennt und untersucht werden, z. B. bei der DNA-Sequenzierung oder beim genetischen Fingerprinting.
- Amplifikation: Die vielleicht häufigste Anwendung ist die PCR, mit der kleinste DNA-Mengen vervielfältigt und vergrößert werden können. Dies ist von unschätzbarem Wert in der Forensik oder der historischen DNA-Analyse.
- Medizinische Anwendungen: Die Technik wird in Krankenhäusern für pränatale Tests, genetische Kartierung, Krebsvorsorge, Gewebetypisierung und Präzisionstherapie bei der Behandlung von Krankheiten eingesetzt.
- Bakterielle/Virale Krankheiten: Durch den Test auf spezifische DNA können bestimmte Infektionskrankheiten ausschließlich durch PCR nachgewiesen werden. Gewebe können auch auf Genexpression analysiert werden, um bestimmte Krankheiten zu testen.
Methodik und Verfahren
Während es je nach dem spezifischen Zweck der DNA unterschiedliche Methoden gibt, gibt es eine allgemeine Vorlage für die PCR. Aufgrund der Empfindlichkeit der DNA-Kontamination folgt die Technik einem sorgfältigen Protokoll, um rein zu bleiben.
- Initialisierung: Bei der Hot-Start-PCR, die für die Amplifikation spezifischer DNA-Arten nützlich ist, wird die Reaktionskammer zunächst für einige Minuten auf etwa 200o F erhitzt.
- Denaturierung: Bei herkömmlichen Techniken wird die Temperatur für einige Sekunden auf etwa 200o F erhöht, um die DNA-Stränge durch Aufbrechen der Wasserstoffbrücken zu denaturieren. Dadurch entstehen zwei getrennte DNA-Stränge, die bereit sind, sich an neue Primer zu heften.
- Ausglühen: Die Temperatur wird gesenkt, aber immer noch über dem Schmelzpunkt gehalten, um eine sehr spezifische Bindung zu ermöglichen. Dadurch können sich die Primer an komplementäre Einzelstränge der DNA anlagern. Die Doppelhelix ist bereit, sich erneut zu bilden.
- Verlängerung: In dieser Phase synthetisiert die DNA-Polymerase einen völlig neuen Strang, indem sie die bereits vorhandenen Primer, die während des Annealing-Schrittes gebildet wurden, verlängert. Durch die Verwendung von dNTP-Phosphatgruppen wird der Strang verlängert. Die Anzahl der DNA-Sequenzen sollte sich verdoppeln. Wenn dNTP und DNA-Polymerase verbraucht sind, kommt es zu einer Abflachungsphase, bis ein Plateau erreicht ist, in dem alle Reagenzien und Enzyme erschöpft sind. Eine genaue Quantifizierung der PCR-Produkte kann aufgrund der unterschiedlichen Plateauphasen unzuverlässig sein. Die Erzeugung jedes Endprodukts wird als ein Zyklus betrachtet. In mehreren Verlängerungszyklen wird exponentiell neue DNA gebildet.
- Endverlängerung: Dieser Schritt ist zwar nicht notwendig, aber sinnvoll, um sicherzustellen, dass alle verbleibenden Stränge verlängert werden.
- Endgültiges Halten: Die Temperatur wird auf etwa 40o F abgekühlt, damit die neu synthetisierten DNA-Stränge vollständig aushärten und für die Lagerung vorbereitet werden können.
Die Rolle von dNTP
Es gibt vier Arten von dNTP, oder Desoxynukleotidtriphosphat, wobei jedes eine andere DNA-Base verwendet: Adenin (dATP), Cytosin (dCTP), Guanin (dGTP) und Thymin (dTTP). Die Verwendung von dNTP während der Verlängerungsphase liefert einzelne Basen, die bereit sind, wie Bausteine in die DNA einzudringen und sie zu verdoppeln.
Da der Zweck der Technik darin besteht, neue DNA zu synthetisieren, liefert dNTP Nukleotide für den „entpackten“ Strang unter Verwendung der Vorlage einer einzelnen Seite. So werden aus einem einzelnen DNS-Strang zwei, und das kann exponentiell weitergehen, solange die Reagenzien bis zur letzten Haltestufe vorhanden sind.
BioChain’s dNTP-Mix-Produkte
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Strenge Kontrollstandards und modernste Technologie gewährleisten die beste Produktqualität. Die Konzentration wird durch optische Dichte-Spektrophotometrie überprüft. Bei der Herstellung wird darauf geachtet, dass DNase- und RNase-Kontaminationen vermieden werden. Dies wird durch Inkubation der Qualität mit radioaktiven Substraten festgestellt.
Jede Charge dNTP wird auch auf ihre Leistung mit Taq/Pfu/T7 DNA-Polymerase und Sequenase getestet. Darüber hinaus wurde das dNTP im BioChain-Labor vor Ort durch lange PCR zur Amplifikation von 15 kb (E. coli-DNA-Template) und 30 kb (Lambda-DNA-Template) auf seine Leistungsfähigkeit getestet.
Einzeln getrennte Basen-Nukleotid-Mischungen sind zusammen mit Hotstart-Taq-DNA-Polymerase-Reagenzien für alle PCR-Anforderungen erhältlich.
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