La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica que utiliza la ADN polimerasa para amplificar una sola hebra o segmento de ADN. Con un producto final que va de miles a millones de copias de ADN, la PCR es una parte muy importante de la investigación médica y clínica. Sus creadores, Kary Mullis y Michael Smith, ganaron el Premio Nobel de Química por su contribución.
La síntesis de ADN mediante PCR se ha utilizado para varias aplicaciones posteriores:
- Aislamiento de ADN: Esta técnica permite separar y estudiar segmentos específicos de ADN, como en los casos de secuenciación de ADN o de huellas genéticas.
- Amplificación: Tal vez el uso más común, la PCR se puede utilizar en las cantidades más pequeñas de ADN recogido para aumentar la cantidad y el tamaño de las muestras. Esto es muy valioso en los análisis forenses o de ADN histórico.
- Usos médicos: La técnica se utiliza en los hospitales para las pruebas prenatales, el mapeo genético, la detección del cáncer, la tipificación de tejidos y la terapia de precisión en el tratamiento de enfermedades.
- Enfermedades bacterianas/virales: Mediante el análisis de ADN específico, se pueden encontrar ciertas enfermedades infecciosas exclusivamente a través de la PCR. Los tejidos también pueden ser analizados para la expresión de genes, probando enfermedades específicas.
Metodología y Proceso
Aunque hay diferentes métodos utilizados dependiendo del propósito específico del ADN, hay una plantilla generalizada para la PCR. Debido a la sensibilidad de la contaminación del ADN, la técnica sigue un protocolo cuidadoso para mantenerse puro.
- Inicialización: Cuando se utiliza la PCR de arranque en caliente, que es útil para amplificar tipos específicos de ADN, la cámara de reacción se calienta primero a unos 200o F durante varios minutos.
- Desnaturalización: En las técnicas habituales, consiste en elevar la temperatura durante varios segundos a unos 200o F para desnaturalizar las hebras de ADN rompiendo los enlaces de hidrógeno. Esto da lugar a dos hebras de ADN separadas, que están listas para unirse a nuevos cebadores.
- Recalentamiento: La temperatura disminuye pero se mantiene por encima de la fusión para facilitar una unión muy específica. Esto permite que los cebadores se unan a las hebras simples complementarias de ADN. La doble hélice está lista para formarse de nuevo.
- Extensión: En esta etapa, la ADN polimerasa sintetiza una hebra completamente nueva mediante la extensión de los cebadores ya disponibles formados durante el paso de recocido. Mediante el uso de grupos fosfato dNTP, la hebra se alarga. El número de secuencias de ADN debe duplicarse. A medida que se agotan los dNTP y la ADN polimerasa, se produce una etapa de nivelación hasta llegar a una meseta en la que se agotan todos los reactivos y enzimas. La cuantificación precisa de los productos de la PCR puede ser poco fiable debido a las diferentes etapas de meseta. La creación final de cada producto se considera un ciclo. El nuevo ADN se crea exponencialmente en múltiples ciclos de extensión.
- Elongación final: Aunque este paso no es necesario, es útil para asegurar que cualquier hebra restante sea alargada.
- Retención final: La temperatura se enfría a unos 40o F para permitir que las hebras de ADN recién sintetizadas se fijen completamente y se preparen para el almacenamiento.
El papel de los dNTP
Hay cuatro tipos de dNTP, o desoxinucleótido trifosfato, y cada uno de ellos utiliza una base de ADN diferente: adenina (dATP), citosina (dCTP), guanina (dGTP) y timina (dTTP). El uso de dNTP durante la fase de extensión proporciona bases simples listas para entrar en el ADN y duplicarlo, como si fueran bloques de construcción.
Dado que el propósito de la técnica es sintetizar nuevo ADN, el dNTP proporciona nucleótidos a la hebra «descompuesta» utilizando la plantilla de una sola cara. Esto convierte una sola hebra de ADN en dos, y puede continuar exponencialmente mientras los reactivos permanezcan presentes hasta la etapa de retención final.
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Cada lote de dNTP se somete también a pruebas de rendimiento con Taq/Pfu/T7 ADN polimerasa y Sequenase. Además, el rendimiento de los dNTP se ha probado en el laboratorio de BioChain mediante una PCR larga para amplificar 15 kb (plantilla de ADN de E. coli) y 30 kb (plantilla de ADN de Lambda).
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