Brug af dNTP i polymerasekædereaktion (PCR) – BioChain Institute Inc.

Polymerasekædereaktion (PCR) er en teknik, der anvender DNA-polymerase til at amplificere en enkelt streng eller et enkelt segment af DNA. Med et slutprodukt, der varierer fra tusindvis til millioner af DNA-kopier, er PCR en yderst vigtig del af medicinsk og klinisk forskning. Udviklerne, Kary Mullis og Michael Smith, har vundet en Nobelpris i kemi for deres bidrag.

DNA-syntese ved hjælp af PCR er blevet anvendt til flere downstream-applikationer:

• DNA-isolering: Denne teknik gør det muligt at adskille og undersøge specifikke DNA-segmenter, f.eks. i tilfælde af DNA-sekventering eller genetisk fingeraftryk.
• Amplifikation: PCR er måske den mest almindelige anvendelse og kan anvendes på de mindste mængder indsamlet DNA for at øge mængden og størrelsen af prøverne. Dette er uvurderligt i retsmedicinske undersøgelser eller historiske DNA-analyser.
• Medicinske anvendelser: Teknikken anvendes på hospitaler til prænatale tests, genetisk kortlægning, kræftscreening, vævstypebestemmelse og præcisionsterapi i forbindelse med sygdomsbehandling.
• Bakterie-/virussygdomme: Ved at teste for specifikt DNA kan visse smitsomme sygdomme udelukkende findes ved hjælp af PCR. Væv kan også analyseres for genekspression, hvorved specifikke sygdomme kan testes.

Metodologi og proces

Selv om der anvendes forskellige metoder afhængigt af det specifikke formål med DNA, er der en generaliseret skabelon til PCR. På grund af DNA-forureningens følsomhed følger teknikken en omhyggelig protokol for at forblive ren.

1. Initialisering: Ved anvendelse af hot-start PCR, som er nyttig til at amplificere specifikke former for DNA, opvarmes reaktionskammeret først til ca. 200o F i flere minutter.
2. Denaturering: Ved almindelige teknikker består dette i at hæve temperaturen i flere sekunder til ca. 200o F for at denaturere DNA-strengene ved at bryde hydrogenbindingerne. Dette resulterer i to separate DNA-strenge, som er klar til at blive knyttet til nye primere.
3. Udglødning: Temperaturen sænkes, men holdes stadig over smeltetemperaturen for at lette en meget specifik binding. Dette gør det muligt for primere at knytte sig til komplementære enkeltstrenge af DNA. Dobbeltspiralen er klar til at blive dannet igen.
4. Forlængelse: På dette stadium syntetiserer DNA-polymerase en helt ny streng ved at forlænge de allerede tilgængelige primere, der er dannet under annealingstrinnet. Ved hjælp af dNTP-fosfatgrupper forlænges strengen. Antallet af DNA-sekvenser bør fordobles. Efterhånden som dNTP og DNA-polymerase er opbrugt, sker der en udjævningsfase, indtil der nås et plateau, hvor alle reagenser og enzymer er opbrugt. Præcis kvantificering af PCR-produkter kan være upålidelig på grund af de forskellige plateaustadier. Den endelige frembringelse af hvert produkt betragtes som én cyklus. Der dannes nyt DNA eksponentielt i flere forlængelsescyklusser.
5. Endelig forlængelse: Selv om dette trin ikke er nødvendigt, er det nyttigt for at sikre, at eventuelle resterende strenge er forlænget.
6. Final Hold: Temperaturen afkøles til ca. 40o F for at give de nyligt syntetiserede DNA-strenge mulighed for at sætte sig helt fast og blive forberedt til opbevaring.

Den rolle, som dNTP spiller

Der findes fire typer dNTP, eller deoxynukleotidtriphosphat, hvor hver bruger en anden DNA-base: adenin (dATP), cytosin (dCTP), guanin (dGTP) og thymin (dTTP). Ved at bruge dNTP i forlængelsesfasen får man enkeltbaser, der er klar til at gå ind i DNA og fordoble det, ligesom byggeklodser.

Da formålet med teknikken er at syntetisere nyt DNA, giver dNTP nukleotider til den “udrappede” streng ved hjælp af skabelonen af en enkelt side. Dette forvandler en enkelt DNA-streng til to, og kan fortsætte eksponentielt, så længe reagenserne forbliver til stede indtil den endelige holdfase.

BioChain’s dNTP-mixprodukter

De dNTP-produkter og -blandinger, der leveres af BioChain, er specielt fremstillet og testet til molekylærbiologiske anvendelser. De kan anvendes i PCR, RT-PCR, DNA-mærkning og DNA-sekventeringsprocesser. DNTP’erne er renset med præparativ HPLC og har en renhed på mindst 99,5 %.

Rigorøse kontrolstandarder og avanceret teknologi sikrer den bedste produktkvalitet. Koncentrationen verificeres ved optisk tæthedsspektrofotometri. Fremstillingen er omhyggelig for at undgå DNase- og RNase-kontaminering. Dette bestemmes ved inkubation af kvaliteten med radioaktive substrater.

Hvert parti dNTP testes også for ydeevne med Taq/Pfu/T7 DNA-polymerase og Sequenase. Endvidere er dNTP blevet testet for ydeevne i BioChain’s laboratorium på stedet ved lang PCR for at amplificere 15 kb (E. coli DNA-skabelon) og 30 kb (Lambda DNA-skabelon).

Individuelt adskilte base-nukleotidblandinger er tilgængelige sammen med Hotstart Taq DNA-polymerasereagenser til alle PCR-behov.

BioChain tilbyder den mest konkurrencedygtige pris på markedet. Rabat ved køb af store mængder/store mængder er tilgængelig.

Find flere dNTP-produkter her!