dNTP:n käyttö polymeraasiketjureaktiossa (PCR) – BioChain Institute Inc.

Polymeraasiketjureaktio (PCR) on tekniikka, jossa DNA-polymeraasia käytetään DNA:n yhden säikeen tai segmentin monistamiseen. Koska lopputuotteena saadaan tuhansista miljooniin DNA-kopioihin, PCR on erittäin tärkeä osa lääketieteellistä ja kliinistä tutkimusta. Kehittäjät, Kary Mullis ja Michael Smith, saivat panoksestaan Nobelin kemianpalkinnon.

DNA:n synteesiä PCR:n avulla on käytetty useissa jatkojalostussovelluksissa:

• DNA:n eristäminen: Tämä tekniikka mahdollistaa tiettyjen DNA-segmenttien erottamisen ja tutkimisen, kuten DNA:n sekvensoinnissa tai geneettisessä sormenjälkitutkimuksessa.
• Amplifiointi: Ehkä yleisin käyttötapa, PCR:ää voidaan käyttää pienimpiinkin kerättyihin DNA-määriin näytteiden määrän ja koon kasvattamiseksi. Tämä on korvaamatonta rikosteknisessä tutkimuksessa tai historiallisessa DNA-analyysissä.
• Lääketieteelliset käyttötarkoitukset: Tekniikkaa käytetään sairaaloissa raskaudenaikaiseen testaukseen, geneettiseen kartoitukseen, syöpäseulontaan, kudostyypitykseen ja täsmähoitoon sairauksien hoidossa.
• Bakteeri- ja virussairaudet: Testaamalla spesifistä DNA:ta, tietyt tartuntataudit voidaan löytää yksinomaan PCR:n avulla. Kudoksista voidaan myös analysoida geeniekspressiota, jolloin voidaan testata tiettyjä sairauksia.

Metodologia ja prosessi

Vaikka DNA:n erityisestä käyttötarkoituksesta riippuen käytetään erilaisia menetelmiä, PCR:lle on olemassa yleinen malli. DNA-kontaminaation herkkyyden vuoksi tekniikassa noudatetaan huolellista protokollaa, jotta se pysyy puhtaana.

1. Alustus: Kun käytetään kuumakäynnistys-PCR:ää, joka on hyödyllinen erityyppisten DNA:n monistamisessa, reaktiokammio kuumennetaan ensin noin 200o F:n lämpötilaan useiden minuuttien ajan.
2. Denaturointi: Tavallisissa tekniikoissa tämä koostuu lämpötilan nostamisesta muutamaksi sekunniksi noin 200o F:n lämpötilaan, jotta DNA-juosteet denaturoituvat rikkoen vetysidoksia. Tuloksena on kaksi erillistä DNA-juostetta, jotka ovat valmiita kiinnittymään uusiin alukkeisiin.
3. Hehkutus: Lämpötilaa alennetaan, mutta se pidetään edelleen sulamisen yläpuolella, jotta hyvin spesifinen sitoutuminen helpottuu. Tämä mahdollistaa alukkeiden kiinnittymisen toisiaan täydentäviin yksittäisiin DNA-juosteisiin. Kaksoiskierre on valmis muodostumaan uudelleen.
4. Laajennus: Tässä vaiheessa DNA-polymeraasi syntetisoi kokonaan uuden säikeen pidentämällä jo käytettävissä olevia alukkeita, jotka muodostuivat annealing-vaiheen aikana. DNTP-fosfaattiryhmien avulla säie pidentyy. DNA-jaksojen määrän pitäisi kaksinkertaistua. Kun dNTP ja DNA-polymeraasi on käytetty loppuun, tapahtuu tasaantumisvaihe, kunnes saavutetaan tasanne, jossa kaikki reagenssit ja entsyymit on käytetty loppuun. PCR-tuotteiden tarkka kvantifiointi voi olla epäluotettavaa erilaisten tasovaiheiden vuoksi. Kunkin tuotteen luominen katsotaan yhdeksi sykliksi. Uutta DNA:ta syntyy eksponentiaalisesti useissa pidennyssykleissä.
5. Lopullinen pidennys: Vaikka tämä vaihe ei ole välttämätön, se on hyödyllinen sen varmistamiseksi, että jäljellä olevat säikeet ovat pidentyneet.
6. Lopullinen pito: Lämpötila jäähdytetään noin 40o F:n lämpötilaan, jotta vastasyntetisoidut DNA-säikeet voivat täysin jähmettyä ja valmistella varastointia varten.

DNTP:n rooli

DNTP:tä eli deoksinukleotiditrifosfaattia on neljää eri tyyppiä, joista kukin käyttää eri DNA:n emästä: adeniini (dATP), sytosiini (dCTP), guaniini (dGTP) ja tymiini (dTTP). Käyttämällä dNTP:tä pidennysvaiheessa saadaan yksittäisiä emäksiä, jotka ovat valmiina menemään DNA:han ja kaksinkertaistamaan sen rakennuspalikoiden tapaan.

Koska tekniikan tarkoituksena on syntetisoida uutta DNA:ta, dNTP:llä saadaan nukleotideja ”purettuun” säikeeseen yhden puolen mallia käyttäen. Tämä muuttaa yhden DNA-juosteen kahdeksi ja voi jatkua eksponentiaalisesti niin kauan kuin reagensseja on läsnä viimeiseen pitovaiheeseen asti.

BioChainin dNTP-sekoitustuotteet

BioChainin tarjoamat dNTP-tuotteet ja -seokset on valmistettu ja testattu erityisesti molekyylibiologisia sovelluksia varten. Niitä voidaan käyttää PCR-, RT-PCR-, DNA-merkintä- ja DNA-sekvensointiprosesseissa. DNTP:t puhdistetaan preparatiivisella HPLC:llä, ja niiden puhtausaste on vähintään 99,5 %.

Kireät valvontastandardit ja uusin teknologia takaavat tuotteen parhaan laadun. Pitoisuus tarkistetaan optisella tiheysspektrofotometrialla. Valmistaminen on huolellista DNaasi- ja RNaasikontaminaation välttämiseksi. Tämä määritetään inkuboimalla laatua radioaktiivisilla substraateilla.

Kunkin dNTP-erän toimivuus testataan myös Taq/Pfu/T7 DNA-polymeraasin ja Sequenasen kanssa. Lisäksi dNTP:n suorituskyky on testattu BioChainin paikan päällä olevassa laboratoriossa pitkällä PCR:llä 15 kb:n (E. coli DNA-malli) ja 30 kb:n (Lambda DNA-malli) monistamiseksi.

Saatavilla on erikseen eroteltuja emäsnukleotidiseoksia sekä Hotstart Taq DNA-polymeraasireagensseja kaikkiin PCR-tarpeisiin.

BioChain tarjoaa markkinoiden kilpailukykyisimmän hinnan. Alennus suurille määrille/eräostoille on saatavilla.

Löydä lisää dNTP-tuotteita täältä!