Användning av DAPI-fluorescenslivstid för att undersöka kromatinkondensering i mänskliga kromosomer

Att det exciterade tillståndet hos fri DAPI och DAPI bundet till DNA

DAPI:s exciterade tillståndslivstid är välkänd26 , så vi mätte livslängden hos obundet DAPI i PBS-lösning (pH 7.2) för att bestämma både systemets känslighet och noggrannheten hos livstidsmätningarna. Fluorescensavklingningen visade en dubbelt exponentiell karaktär: fluorescenslivslängdskomponenter, τ och intensitetskoefficienter, a, redovisas i tabell 1. Värdet för den långa livstidskomponenten stämmer väl överens med litteraturen medan värdet för den korta livstidskomponenten är högre än vad som beskrivs i litteraturen vid pH 7 där värdeintervallet är 0,19-0,24 ns26.

Nästan mätte vi livslängden för DAPI bundet till DNA som innehåller olika mängder AT- och GC-baser för att avgöra om DNA-basens sammansättning har någon effekt på DAPI-livstiden. DNA från kalvthymus (CT) och DNA från micrococcus luteus (ML) användes för denna del av studien på grund av deras olika sammansättning av baspar (42 % GC för CT-DNA och 72 % GC för ML-DNA). Tre lösningar av vardera CT- och ML-dna mättes. DAPI-livstiderna för varje typ av DNA uppvisade två komponenter (tabell 1). Den korta livstidskomponenten för DAPI bundet till ML DNA är något högre än för CT DNA (130 ps skillnad). Det finns ingen signifikant skillnad observerad mellan de långa livstidskomponenterna.

FLIM av DAPI bundet till fixerade metafasekromosomer från B-lymfocyter

Figur 1a visar en livstidsbild av en typisk ”spridning” av mänskliga metafasekromosomer fixerade i 3:1 metanol:ättiksyra (se Metoder för definition av kromosomspridning). En expanderad bild av det inneslutna området i figuren tagen med högre pixelupplösning visas i fig. 1b. Falsk färg används för att representera livstidsvärdet vid varje bildpixel.

Båda figurerna visar att det finns en variation i DAPI:s livstid längs kromosomernas längd. DAPI-fluorescensavklingningskurvorna med normaliserade intensiteter presenteras också i figur 1b för att komplettera livstidsbilderna och visar att DAPI-molekylernas fluorescens i de röda regionerna har en snabbare avklingning än den i de blå regionerna. Medellivslängden ± standardavvikelsen (SD) för DAPI för den uppmätta kromosomspridningen i fig. 1a bestämdes till 2,91 ± 0,12 ns; fluorescensavklingningen av DAPI visade sig ha en enda exponentiell karakteristik.

Identifiering av heteromorfa regioner i kromosomer

Tolv kromosomspridningar (GM18507-celler) med 46 kromosomer vardera mättes från tre objektglas. Figur 2a visar en livstidsbild av en av de uppmätta spridningarna. I var och en av de uppmätta spridningarna fann vi att vissa kromosomer har specifika regioner längs sin längd som har betydligt kortare livslängd än resten av kromosomen, oftast i nära anslutning till centromererna. Dessa regioner visas röda i livstidsbilderna på grund av den färgskala som används; vi kommer att referera till dem som regioner med kort livstid.

Livslängdsfördelningskurvorna med normaliserade frekvenser för de regioner med kort livslängd och resten av kromosomerna i fig. 2a visas i fig. 2b. Medellivslängden ± SD för DAPI-molekylerna i regionerna med kort livslängd i fig. 2a bestämdes till 2,48 ± 0,13 ns medan den för molekylerna i resten av kromosomerna i spridningen bestämdes till 2,80 ± 0,09 ns. Standardavvikelserna representerar hur varierande livstidsvärdena är inom regionerna med kort livstid och resten av kromosomerna för den uppmätta spridningen.

Vi misstänkte att regionerna med kort livstid motsvarade heteromorfa regioner i kromosomerna. Sådana regioner uppvisar variationer i morfologi på specifika platser samtidigt som de inte påverkar fenotypen och är ofta heterokromatiska till sin natur. Kända morfologiska variationer i heteromorfa regioner har förknippats med livslängd och infertilitet och är därför av stort intresse för genetiska studier. Det är känt att heteromorfa regioner förekommer på kromosomerna 1, 9, 15, 16 och Y-kromosomen27.

Det beslutades att utföra mFISH-experiment (se Metoder) på alla uppmätta spridningar för att identifiera de kromosomer som innehåller regionerna med kort livslängd. MFISH-bilden och karyotypen för spridningen i fig. 2a visas i fig. 2c,d respektive. De regioner som uppvisar kortare livslängd, jämfört med resten av kromosomerna, i alla uppmätta spridningar identifierades som de pericentromeriska regionerna av kromosomerna 1, 9 och 16, den korta armen av kromosom 15 och den distala regionen av kromosom Y. Dessa regioner är kända för att vara heteromorfa regioner, vilket bekräftar vår hypotes.

Tabell 2 visar medelvärdet av DAPI:s livslängd för var och en av de heteromorfa regionerna i fig. 2a. Eftersom varje autosom uppträder två gånger har medellivslängden och standardavvikelserna för de heteromorfa regionerna som erhållits för autosomer med samma kromosomnummer medelvärdesberäknats respektive sammanförts.

Det framgår av tabellen att de uppmätta livslängderna för de heteromorfa regionerna för kromosomerna 1, 16 och Y är likartade och betydligt längre än för kromosomerna 9 och 15. Den heteromorfa regionen i kromosom 9 kan beskrivas med två livslängder så att region 9a har ett liknande värde som kromosom 15 medan region 9b har en kortare livslängd än region 9a.

De andra uppmätta spridningarna (se tabellerna S1-S11 i det kompletterande materialet) visar en liknande trend där de heteromorfa regionerna i kromosomerna 9 och 15 har kortare livslängder än de i kromosomerna 1, 16 och Y.

Trender i DAPI-livstid med kromosomområde

Kromosomer är kända för att bli progressivt mer kompakta när de närmar sig cellcykelns metafasstadium; Colcemid användes för den här studien för att blockera cellerna i detta skede före skörd. Cellerna i den synkroniserade populationen förväntas dock inte alla befinna sig exakt i samma kondensationsstadium vid skörden. Denna variation i kompakteringen återspeglas i variationen i den relativa arean av en viss kromosom från en kromosomspridning till en annan på samma objektglas, där de mer kompakta kromosomerna har mindre areor. Vi förväntade oss att olika tillstånd av kompaktering skulle kunna ha en effekt på de observerade fluorescenslivslängderna. För att mäta effekten av kromatinkompaktering på livslängderna korrelerade vi de genomsnittliga DAPI-livstiderna för olika exempel på kromosom 1:s (GM18507-celler) från ett objektglas och deras heteromorfa områden med den uppmätta kromosomarean. Som tidigare beskrivits gjordes ett medelvärde av livstidsvärdena för kromosompar, pixlar tilldelades en färg enligt livstidsvärdet och regioner med kort livstid (röda regioner) ansågs vara heteromorfa till sin natur. Segmentering och analys av de heteromorfa regionerna och beräkning av kromosomområdena utfördes med hjälp av programvaran Avizo.

Grafen i fig. 3 visar att medellivslängden för DAPI för kromosom 1 och dess heteromorfa region minskar kraftigt med minskad kromosom 1-yta. I den mån kromosomens yta i en spridning representerar packningstätheten tyder den observerade trenden på ett linjärt beroende av tätheten, som representerar graden av kondensering. En liknande trend observeras också för kromosomspridningar på ett annat objektglas (se figur S1).

Effekt av DAPI-koncentrationen på livslängden

Den genomsnittliga DAPI-livstiden för olika kromosomer 1 (GM18507-celler) färgade med olika DAPI-koncentrationer uppmättes för att bestämma effekten av DAPI-koncentrationen på livslängden. Tolv kromosom 1:or, med ungefär samma yta, från samma objektglas mättes för varje koncentration.

Det kan observeras i tabell 3 att den totala intensiteten för kromosom 1 ökade när koncentrationen av DAPI ökade. Det fanns dock ingen signifikant variation observerad i DAPI-livstiden mellan de olika koncentrationerna.

FLIM av Hoechst 33258 bundet till fixerade metafasekromosomer

För att bekräfta att de variationer i livstid som vi har observerat längs kromosomernas längd är en funktion av kromatinstrukturen och inte beror på några effekter som är specifika för DAPI, utförde vi FLIM med hjälp av ett annat färgämne som binder till minor-groove. Metafasekromosomer (GM18507-celler) fixerade i 3:1 metanol:ättiksyra färgades med Hoechst 33258.

Figur 4 visar livstidsbilden av den uppmätta kromosomspridningen. Fluorescensavklingningen av Hoechst 33258 bundet till kromosomerna visade sig ha en enkel exponentiell karakteristik, liknande den för DAPI. Medellivslängden ± SD för Hoechst 33258 för den uppmätta spridningen fastställdes till 2,42 ± 0,05 ns. Den mindre standardavvikelsen jämfört med den för de DAPI-färgade kromosomerna (0,12 ns) visar att variationen i Hoechst 33258:s livslängd över spridningen inte är lika stor som den som observerats för de DAPI-färgade kromosomerna. Livstidsbilden visar att de heteromorfa regionerna i kromosomerna 1, 9, 15, 16 och Y uppvisade betydligt kortare livstidsvärden än resten av kromosomerna (se figur S2 för mFISH-bilden och karyotypen), vilket liknar det som observerades för de DAPI-färgade kromosomerna. Medellivslängden ± SD för Hoechst 33258-molekylerna i de heteromorfa regionerna fastställdes till 2,36 ± 0,03 ns medan den för molekylerna i resten av kromosomerna i spridningen fastställdes till 2,43 ± 0,04 ns. De genomsnittliga Hoechst 33258-livstidsvärdena och standardavvikelserna för var och en av de heteromorfa regionerna i kromosomerna 1, 9, 15, 16 och Y, jämfört med resten av kromosomen, presenteras i tabell S12.

Detta ytterligare experiment med Hoechst bekräftar att de variationer i livslängd som observerats längs kromosomernas längd orsakas av den lokala kromatinstrukturen och inte av den använda fluoroforen.

FLIM av DAPI bundet till fixerade metafasekromosomer från HeLa-celler

FLIM-mätningar på DAPI-färgade metafasekromosomer som erhållits från HeLa-celler som fixerats i 3:1 metanol:ättiksyra utfördes också för att verifiera att de variationer i DAPI-livstiden som observerats längs kromosomernas längd inte bara är celllinjespecifika utan beror på den allmänna kromatinstrukturen.

Figur 5a visar den uppmätta kromosomspridningen. Medellivslängden ± SD för DAPI för den uppmätta spridningen fastställdes till 2,93 ± 0,09 ns. Kortare DAPI-livstider, jämfört med resten av kromosomerna, observeras vid de heteromorfa regionerna av kromosomerna 1, 9, 15, 16 och Y (se figur S3 för mFISH-bilden och karyotypen), i likhet med vad som observerats för GM18507-cellerna. Fyra onormala kromosomer som består av en del av antingen kromosom 1 eller 9 uppvisade också kortare DAPI-livstider i sina pericentromeriska regioner, vilket tyder på att de innehåller den heteromorfa regionen av kromosom 1 eller 9. Livslängdsfördelningskurvorna med normaliserade frekvenser för regionerna med kort livslängd och resten av kromosomerna visas i fig. 5b. Medellivslängden för DAPI-molekylerna i regionerna med kort livslängd fastställdes till 2,68 ± 0,08 ns medan medellivslängden för molekylerna i resten av kromosomerna i spridningen fastställdes till 2,93 ± 0,08 ns.

FLIM av DAPI bundet till kromosomer i interfas inom fixerade kärnor

Livslängden för DAPI bundet till kromosomer i interfas inom en 3:1 metanol:ättiksyra fixerad kärna från cellinjen GM18507-lymfocytcellen avbildades också, vilket visas i fig. 6. En z-stack av kärnan togs med hjälp av ett konfokalt mikroskop med multifoton excitation (vid 760 nm). Fig. 6a,c visar bilder som tagits vid -0,50 μm respektive +0,50 μm från det ursprungliga fokalplanet (fig. 6b).

En enda exponentiell karaktär observerades för DAPI-fluorescensavklingningen. Livstidsbilderna av den uppmätta kärnan visar att det finns en stark variation i DAPI-livstiden över interfaskärnan, där lokaliserade områden med korta livstider kan observeras (indikerade med pilar i fig. 6). Även om den fixerade kärnan är något hoptryckt jämfört med sin ursprungliga sfäriska form som ett resultat av fixeringsprocessen, visar detta platserna för regionerna med kort livstid i tre dimensioner. 3D-rekonstruktion av de konfokala z-stackbilderna (se figur S4) och kvantitativ analys av regionerna med kort livslängd utfördes med hjälp av programvaran Avizo.

Tabell 4 visar volymen, medellivslängden och positionen med avseende på kärnans radie för regionerna med kort livslängd. De beräknade volymerna för regionerna med kort livslängd visar sig vara större än den typiska volymen för en kromosom i metafas (~1-3 um3), vilket tyder på en betydande dekompaktering av kromatin i interfasen. Positionerna för regionerna med kort livslängd beräknades för att avgöra om de har preferentiella platser i kärnan. Av tabellen framgår att regionerna med kort livslängd ligger närmare kärnans periferi än dess centrum. Vi undersökte tre kärnor i den här studien och fann att alla uppvisade en liknande fördelning av regioner med kort livstid (se figurerna S6 och S7 för de andra två kärnorna).

DAPI-färgade interfas-kromosomer inom en kärna från CCD37LU lungfibroblastceller som fixerats i 3:1 metanol:ättiksyra mättes också, vilket framgår av fig. 7a. Bilden visar förekomsten av områden med kort livslängd inom kärnan, liknande den som observerades i GM18507-lymfocytcellerna. De korta livstidsregionerna har dock ingen preferentiell placering inom kärnan. Figur 7b visar FISH-bilden av den uppmätta kärnan. Kromosom 9:s centromersond visas som röd i bilden. Om man jämför figurerna 7a och 7b kan man konstatera att platsen för kromosom 9:s centromersond överlappar den för de två regionerna med kort livslängd. En annan uppmätt kärna visar ett liknande resultat och presenteras i figur S8.