Excited State Characteristics of free DAPI and DAPI Bound to DNA
DAPIの励起状態寿命はよく知られているので26、我々はPBS溶液（pH 7.）中で未結合のDAPIの寿命測定した。2)で測定し、システムの感度と寿命測定の精度の両方を確認した。 蛍光減衰は二重指数関数的な性質を示した。蛍光寿命成分、τおよび強度係数、aを表1に報告する。 長寿命成分の値は文献とよく一致し、短寿命成分の値はpH7で0.19-0.24 ns26と文献に記載されている値より高い。
次に、DNA塩基組成がDAPI寿命に何らかの影響を与えるかどうかを調べるために、異なる量のATおよびGC塩基を含むDNAに結合したDAPIの寿命を測定しました。 DNAの塩基組成がDAPIの寿命に影響を与えるかどうかを調べるため、AT塩基とGC塩基の量が異なるDNAを結合させたDAPIの寿命を測定したところ、Calf thymus (CT) と micrococcus luteus (ML) のDNAは塩基対組成（CT DNAは42％GC、 ML DNAは72％GC）が異なるためこの部分の研究に使用された。 CTとMLのDNAをそれぞれ3溶液ずつ測定した。 それぞれのDNAのDAPI寿命は2つの成分を示した（表1）。 ML DNAに結合したDAPIの短寿命成分は、CT DNAのそれよりもわずかに高い（130 psの差）。
FLIM of DAPI B-Lymphocytes
Figure 1aは3：1メタノール：酢酸で固定したヒト中期染色体の典型的な「広がり」の生涯画像です（染色体広がりの定義については方法を参照ください）。 図1bは、図中の囲んだ領域をより高い画素数で拡大した画像です。 図1
染色体の長さに沿ったDAPI寿命の変動。
(a)染色体の広がり(スケールバー=10μm)、(b)図1aの囲み領域の拡大画像(スケールバー=2μm)をより高いピクセル分解能で撮影したもの。 図1bの挿入図：図1bの9番染色体の赤、緑、青の領域から選択した画素における正規化DAPI蛍光減衰曲線。 寿命のカラースケールの範囲は、示すように2.50ナノ秒（赤）から3.14ナノ秒（青）までである。
両図は、染色体の長さに沿ってDAPIの寿命に変動があることを示す。 また、寿命画像を補完するために、強度を規格化したDAPI蛍光減衰曲線を図1bに示したが、赤い領域のDAPI分子の蛍光は、青い領域のそれよりも減衰が速いことがわかる。 図1aの染色体スプレッドの平均寿命±標準偏差（SD）は2.91 ± 0.12 nsとなり、DAPIの蛍光減衰は単一指数特性を持つことが分かりました。
染色体における異形領域の同定
46本の染色体からなる12本の染色体（GM18507細胞）が3つのスライドで測定されました。 図2aは測定したスプレッドの1つの寿命画像である。 各スプレッドにおいて、ある染色体には、その長さ方向に、他の染色体よりも著しく寿命の短い領域があり、その多くはセントロメアの近傍にあることが分かりました。 図2
染色体における異形性領域の同定(
(a)Lifetime image of a chromosome spread with arrow showing the heteromorphic regions (scale bar = 10 μm)、
染色体に存在する同定された同形性のある領域（矢印で示す）。 (b)異形染色体領域と残りの染色体の正規化された寿命分布曲線。 (c) 染色体の広がりを測定したmFISH画像。 (d) 図2a,cの染色体の色に基づく核型分析。
図2aの短寿命領域と残りの染色体の頻度を正規化した寿命分布曲線を図2bに示す。 図2aの短寿命領域のDAPI分子の平均寿命±SDは2.48±0.13nsと決定され、スプレッド内の残りの染色体の分子の寿命は2.80±0.09nsと決定された。
我々は、短寿命領域が染色体の異形領域に相当するのではないかと考えた。 このような領域は、表現型に影響を与えないものの、特定の位置で形態が変化しており、その性質上ヘテロクロマチックである場合が多い。 異型染色体領域の形態的変異は、長寿や不妊と関連していることが知られており、遺伝学的研究において非常に興味深いものである。 異形性領域は1番、9番、15番、16番、Y染色体に存在することが知られている27。
短寿命領域を含む染色体を特定するために、測定したすべてのスプレッドに対してmFISH実験（方法参照）を行うことになった。 図2aのスプレッドのmFISH像と核型をそれぞれ図2c,dに示す。 測定したすべてのスプレッドで、他の染色体に比べて短い寿命を示す領域は、1、9、16番染色体の近心領域、15番染色体の短腕、Y染色体の遠位領域であることが判明しました。これらの領域は異形染色体領域であることが知られており、我々の仮説を裏付けるものとなりました。 各常染色体は2回出現するので、同じ染色体番号の常染色体について得られた異形領域の平均寿命と標準偏差をそれぞれ平均してプールした。
表から、1番、16番、Y番の異形性領域の寿命はほぼ同じで、9番、15番より有意に長いことが観察されます。
他の測定値（補足資料の表S1-S11参照）でも、9番と15番の異形性領域は、1番、16番、Y番よりも寿命が短く、同様の傾向が見られます。
染色体面積によるDAPI寿命の傾向
染色体は細胞周期のメタフェースに近づくと徐々にコンパクトになることが知られており、この研究ではコルセミドを用いてこの段階の細胞をブロックしてから採取した。 しかし、同期させた集団の細胞は、収穫時にすべて全く同じ凝縮の段階にあるわけではないと予想される。 この凝縮のばらつきは、同じスライド上のある染色体のスプレッドと別の染色体の相対的な面積のばらつきに反映され、よりコンパクトな染色体はより小さな面積を持つことになります。 このような凝縮状態の違いが、観察される蛍光寿命に影響を与えるのではないかと予想された。 そこで、1本のスライドに含まれる様々な1番染色体（GM18507細胞）とその異型領域のDAPI寿命の平均値と、測定した染色体面積の相関を測定しました。 前述のように、染色体対の寿命値を平均化し、寿命値に応じて画素に色を付け、寿命の短い領域（赤色領域）を異形領域とした。 異形領域のセグメンテーションと解析、染色体面積の算出は、Avizoというソフトウェアを用いて行った。
図3のグラフから、1番染色体とその異形領域のDAPIの平均寿命は、1番染色体の面積が小さくなると強く低下することがわかる。 染色体の面積が充填密度を表す限り、この傾向は密度に対する線形依存性を示唆し、凝縮の程度を表しています。 図3
様々な1番染色体とその異型領域のDAPIの平均蛍光寿命は、染色体の面積に対してプロットされています。 このように、DAPIは一般的な染色体長の短縮にも、局所的な染色体下の凝縮にも感度が高い。
Effect of DAPI Concentration on Lifetime
異なるDAPI濃度で染色した種々の第1染色体の平均DAPIライフタイムを測定してDAPI濃度と寿命との影響を明らかにした。 同じスライドからほぼ同じ面積の1番染色体12本を各濃度で測定しました。
表3から、DAPIの濃度を上げると1番染色体の総強度が上昇することが観察されます。 しかし、DAPIのライフタイムには、異なる濃度間で大きな変化は観察されなかった。
FLIM of Hoechst 33258 Bound to Fixed Metaphase Chromosomes
染色体の長さに沿った寿命の変化が、DAPI特有の効果ではなくクロマチン構造の関数であることを確認するために、別の小溝結合色素を用いてFLIMを実施しました。 メタノール：酢酸＝3：1で固定したメタフェース染色体（GM18507細胞）をHoechst 33258で染色した。
図4は測定した染色体の広がりの寿命画像である。 染色体に結合したHoechst 33258の蛍光減衰は、DAPIと同様に単一指数関数的な特性を持つことがわかった。 測定された広がりに対するHoechst 33258の平均寿命±SDは2.42±0.05nsであると決定された。 DAPI染色体の寿命（0.12ナノ秒）と比べて標準偏差が小さいことから、広がりを持つHoechst 33258の寿命のばらつきは、DAPI染色体の場合ほど大きくはないことがわかる。 1番、9番、15番、16番、Y番の異形染色体領域は、他の染色体領域よりも有意に短い寿命値を示し（mFISH像と核型は図S2参照）、DAPI染色体の場合と同様であることが寿命画像からわかる。 異形染色体領域におけるHoechst 33258分子の平均寿命±SDは2.36 ± 0.03 nsと決定されたのに対し、スプレッド内の残りの染色体における分子の寿命は2.43 ± 0.04 nsと決定された。 染色体1、9、15、16、Yの各異型領域のHoechst 33258の寿命の平均値と標準偏差を、染色体の残りの部分と比較して、表S12に示した。
Hoechst 33258で染色した染色体の広がりと、矢印で示した異形領域（スケールバー＝10μm）の寿命の画像。
Hoechstを用いたこの追加実験により、染色体の長さに沿って観察される寿命の変動は、使用した蛍光剤ではなく、局所的なクロマチン構造に起因することが確認されました。
FLIM of DAPI Bound to Fixed Metaphase Chromoses from HeLa Cells
DAPI-stained metaphase chromosomes obtained from HeLa cells fixed in 3:1 methanol:acetic acidもまた、DAPI lifetime observation in the length is just cell line specific not due to the general chromatin structureとして、Flim計測を行いました。
図5aは、測定した染色体の広がりを示したものである。 測定された広がりに対するDAPIの平均寿命±SDは、2.93±0.09nsであると決定された。 他の染色体と比較して短いDAPI寿命は、GM18507細胞で観察されたのと同様に、1、9、15、16およびY染色体の異形領域（mFISH画像および核型については図S3参照）において観察される。 1番または9番の一部からなる4本の異常染色体も、その近心領域でDAPIの寿命が短く、1番または9番の異形領域を含んでいることが示唆された。 図5bに、短寿命領域とそれ以外の染色体について、頻度を正規化した寿命分布曲線を示しました。 短寿命領域のDAPI分子の平均寿命は2.68 ± 0.08 ns、残りの染色体の寿命は2.93 ± 0.08 nsと決定され、スプレッドに含まれる染色体の分子の寿命は、2.93 ± 0.08 nsと決定された。
HeLa細胞から得られた染色体における異形性領域の同定(
) (a) 異形性を示す矢印の付いた染色体の拡散の寿命画像です。 黄色の破線枠で囲んだ染色体が異常染色体である（スケールバー＝10μm）。 (b) 異形染色体領域とそれ以外の染色体の正規化した寿命分布曲線。
FLIM of DAPI Bound to Interphase Chromosomes within Fixed Nuclei
GM18507リンパ球細胞株の3：1メタノール：酢酸固定核内の間期染色体に結合したDAPIの寿命も図6のように画像化された。 核のZスタックは、多光子励起（760 nm）共焦点顕微鏡で撮影された。 図6a,cは、それぞれ元の焦点面（図6b）から-0.50 μmと+0.50 μmで得られた画像である。
GM18507細胞の間期核の寿命画像のzスタックから選択した焦点面、（a）は -0.50 μm、（b）0 μm、（c） +0.50 μmでの焦点面。50μm焦点（スケールバー＝5μm、zスタックの全焦点面は図S5参照）
DAPI蛍光減衰には単一の指数関数的特性が観察された。 測定した核の寿命画像を見ると、間期核全体でDAPI寿命に強い変動があり、寿命の短い局所領域が観察される（図6に矢印で示す）。 固定した核は、固定処理の結果、本来の球形に比べてややつぶれているが、これは短寿命領域の位置を3次元的に示している。 共焦点Zスタック画像の3次元再構成（図S4参照）と短寿命領域の定量分析は、Avizoソフトウェアを用いて行った。
表4は、短寿命領域の体積、平均寿命、核の半径に対する位置である。 短寿命領域の体積はメタフェース染色体の体積（1-3 um3）よりも大きく、間期においてクロマチンがかなり圧縮されていることが示唆された。 また、短寿命領域の位置を計算し、核内に優先的に配置されるかどうかを調べた。 表から、短寿命領域は核の中心よりも周辺部に近い位置にあることが観察された。 今回、3つの核を調べたが、いずれも同様の短寿命領域の分布を示した（他の2つの核については図S6、S7参照）。
3：1メタノール：酢酸で固定した肺線維芽細胞の核内のDAPI染色間期染色体も測定し、図7aのような結果を得た。 この画像から、GM18507リンパ球細胞で観察されたのと同様に、核内に短寿命領域が存在することがわかる。 しかし、この短寿命領域は核内に優先的な位置を持たない。 図7bは、測定された核のFISH画像である。 染色体9のセントロメアプローブは画像中で赤く表示されている。 図7a,bを比較すると、9番染色体セントロメアプローブの位置は、短寿命領域の2つと重なっていることがわかる。 図7
CCD37LU細胞における間期核のFLIM画像。 赤の破線で囲まれた短寿命領域が9番染色体の一部であることが確認された（スケールバー＝5μm）。 (b)測定した核のFISH画像。9番染色体のセントロメアプローブの位置を示している（スケールバー＝5μm）。 プローブの位置は、図7aで囲んだ短寿命領域の位置と重なる。