Angeregte Zustandsmerkmale von freiem DAPI und an DNA gebundenem DAPI
Die Lebensdauer von DAPI im angeregten Zustand ist gut bekannt26, daher haben wir die Lebensdauer von ungebundenem DAPI in PBS-Lösung (pH 7.2), um sowohl die Empfindlichkeit des Systems als auch die Genauigkeit der Lebensdauermessungen zu bestimmen. Der Fluoreszenzabfall zeigte einen doppelt exponentiellen Charakter: Die Komponenten der Fluoreszenzlebensdauer τ und die Intensitätskoeffizienten a sind in Tabelle 1 angegeben. Der Wert der langen Lebensdauerkomponente stimmt gut mit der Literatur überein, während der Wert der kurzen Lebensdauerkomponente höher ist als der in der Literatur beschriebene Wert bei pH 7, wo der Wertebereich 0,19-0,24 ns26 beträgt.
Als nächstes haben wir die Lebensdauern von DAPI gemessen, das an DNA gebunden ist, die unterschiedliche Mengen an AT- und GC-Basen enthält, um festzustellen, ob die Zusammensetzung der DNA-Basen einen Einfluss auf die DAPI-Lebensdauer hat. Für diesen Teil der Studie wurde DNA aus Kalbsthymus (CT) und Micrococcus luteus (ML) verwendet, da sie unterschiedliche Basenpaar-Zusammensetzungen aufweisen (42% GC für CT-DNA und 72% GC für ML-DNA). Es wurden jeweils drei Lösungen von CT- und ML-DNA gemessen. Die DAPI-Lebensdauern für jeden DNA-Typ wiesen zwei Komponenten auf (Tabelle 1). Die kurze Lebensdauerkomponente von an ML-DNA gebundenem DAPI ist etwas höher als die der CT-DNA (130 ps Unterschied). Zwischen den Komponenten mit langer Lebensdauer ist kein signifikanter Unterschied festzustellen.
FLIM von DAPI, das an fixierte Metaphase-Chromosomen aus B-Lymphozyten gebunden ist
Abbildung 1a zeigt ein Lebensdauerbild einer typischen „Ausbreitung“ menschlicher Metaphase-Chromosomen, die in 3:1 Methanol:Essigsäure fixiert wurden (siehe Methoden für die Definition der Chromosomenausbreitung). Ein erweitertes Bild des eingeschlossenen Bereichs in der Abbildung, das mit einer höheren Pixelauflösung aufgenommen wurde, ist in Abb. 1b zu sehen. Falsche Farbe wird verwendet, um den Lebenszeitwert an jedem Bildpixel darzustellen.
Variationen der DAPI-Lebensdauer entlang der Länge der Chromosomen.
Lebensdauerbilder von (a) einem ausgebreiteten Chromosom (Maßstabsbalken = 10 μm) und (b) ein erweitertes Bild der eingeschlossenen Region in Abb. 1a, aufgenommen mit einer höheren Pixelauflösung, das die Chromosomen 1 und 9 zeigt (Maßstabsbalken = 2 μm). Abbildung 1b: normalisierte DAPI-Fluoreszenz-Abklingkurven an ausgewählten Pixeln aus den roten, grünen und blauen Regionen in Chromosom 9 in Abb. 1b. Der Bereich der Lebensdauer-Farbskala reicht von 2,50 ns (rot) bis 3,14 ns (blau), wie gezeigt.
Beide Abbildungen zeigen, dass die Lebensdauer von DAPI über die Länge der Chromosomen variiert. Die DAPI-Fluoreszenz-Abklingkurven mit normalisierten Intensitäten sind ebenfalls in Abb. 1b dargestellt, um die Lebensdauerbilder zu ergänzen, und zeigen, dass die Fluoreszenz der DAPI-Moleküle in den roten Regionen schneller abklingt als in den blauen Regionen. Die mittlere Lebensdauer ± Standardabweichung (SD) von DAPI für die gemessene Chromosomenspreizung in Abb. 1a wurde mit 2,91 ± 0,12 ns bestimmt; der Fluoreszenzabfall von DAPI hat eine einfache exponentielle Charakteristik.
Identifizierung heteromorpher Regionen in Chromosomen
Zwölf Chromosomenspreizungen (GM18507-Zellen) mit jeweils 46 Chromosomen wurden von drei Objektträgern gemessen. Abbildung 2a zeigt ein Lebenszeitbild eines der gemessenen Spreads. Bei jedem der gemessenen Spreizungen haben wir festgestellt, dass bestimmte Chromosomen entlang ihrer Länge bestimmte Regionen aufweisen, die eine deutlich kürzere Lebensdauer haben als der Rest des Chromosoms, meist in der Nähe der Zentromere. Diese Regionen erscheinen in den Lebenszeitbildern aufgrund der verwendeten Farbskala rot; wir bezeichnen sie als Regionen mit kurzer Lebensdauer.
Identifizierung heteromorpher Regionen in Chromosomen.
(a) Lebenszeitbild einer Chromosomenausbreitung mit Pfeilen, die die heteromorphen Regionen zeigen (Maßstabsbalken = 10 μm). (b) Normalisierte Lebenszeitverteilungskurven für die heteromorphen Regionen und den Rest der Chromosomen, die kürzere DAPI-Lebensdauern für die heteromorphen Regionen als für den Rest der Chromosomen zeigen. (c) mFISH-Bild der gemessenen Chromosomenverteilung. (d) Karyotypisierung der Chromosomen in Abb. 2a,c anhand der Farbe.
Die Verteilungskurven der Lebensdauer mit normalisierten Häufigkeiten für die Regionen mit kurzer Lebensdauer und den Rest der Chromosomen in Abb. 2a sind in Abb. 2b dargestellt. Die mittlere Lebensdauer ± SD der DAPI-Moleküle in den Regionen mit kurzer Lebensdauer in Abb. 2a wurde mit 2,48 ± 0,13 ns bestimmt, während die Lebensdauer der Moleküle in den übrigen Chromosomen in der Verteilung mit 2,80 ± 0,09 ns bestimmt wurde. Die Standardabweichungen geben an, wie unterschiedlich die Lebensdauerwerte innerhalb der Regionen mit kurzer Lebensdauer und der übrigen Chromosomen für die gemessene Streuung sind.
Wir vermuteten, dass die Regionen mit kurzer Lebensdauer heteromorphen Regionen in Chromosomen entsprechen. Solche Regionen weisen an bestimmten Stellen morphologische Variationen auf, die sich jedoch nicht auf den Phänotyp auswirken, und sind oft heterochromatischer Natur. Bekannte morphologische Variationen heteromorpher Regionen wurden mit Langlebigkeit und Unfruchtbarkeit in Verbindung gebracht und sind daher in genetischen Studien von großem Interesse. Es ist bekannt, dass heteromorphe Regionen auf den Chromosomen 1, 9, 15, 16 und dem Y-Chromosom27 vorkommen.
Es wurde beschlossen, mFISH-Experimente (siehe Methoden) an allen gemessenen Ausbreitungen durchzuführen, um die Chromosomen zu identifizieren, die die Regionen mit kurzer Lebensdauer enthalten. Das mFISH-Bild und der Karyotyp der Ausbreitung in Abb. 2a sind in Abb. 2c und d dargestellt. Die Regionen, die im Vergleich zum Rest der Chromosomen eine kürzere Lebensdauer aufweisen, wurden in allen gemessenen Ausbreitungen als die perizentromerischen Regionen der Chromosomen 1, 9 und 16, der kurze Arm von Chromosom 15 und die distale Region von Chromosom Y identifiziert; diese Regionen sind als heteromorphe Regionen bekannt, was unsere Hypothese bestätigt.
Tabelle 2 zeigt den mittleren Lebensdauerwert von DAPI für jede der heteromorphen Regionen in Abb. 2a. Da jedes Autosom zweimal vorkommt, wurden die mittleren Lebensdauern und Standardabweichungen für die heteromorphen Regionen, die für Autosomen mit der gleichen Chromosomennummer ermittelt wurden, gemittelt bzw. gepoolt.
Aus der Tabelle ist ersichtlich, dass die gemessenen Lebensdauern für die heteromorphen Regionen der Chromosomen 1, 16 und Y ähnlich und deutlich länger sind als die der Chromosomen 9 und 15. Die heteromorphe Region von Chromosom 9 kann durch zwei Lebensdauern beschrieben werden, so dass Region 9a einen ähnlichen Wert wie die von Chromosom 15 hat, während Region 9b eine kürzere Lebensdauer als die von Region 9a hat.
Die anderen gemessenen Streuungen (siehe Tabellen S1-S11 in den ergänzenden Materialien) zeigen einen ähnlichen Trend, dass die heteromorphen Regionen von Chromosom 9 und 15 kürzere Lebensdauern als die von Chromosom 1, 16 und Y haben.
Trends in der DAPI-Lebensdauer mit der Chromosomenfläche
Chromosomen werden bekanntermaßen zunehmend kompakter, wenn sie sich dem Metaphasenstadium des Zellzyklus nähern; für diese Studie wurde Colcemid verwendet, um die Zellen in diesem Stadium vor der Ernte zu blockieren. Es ist jedoch nicht davon auszugehen, dass sich alle Zellen der synchronisierten Population bei der Ernte genau im gleichen Stadium der Verdichtung befinden. Diese Variation in der Verdichtung spiegelt sich in der Variation der relativen Fläche eines bestimmten Chromosoms von einer Chromosomenausbreitung zur anderen auf demselben Objektträger wider, wobei die kompakteren Chromosomen kleinere Flächen aufweisen. Wir gingen davon aus, dass unterschiedliche Verdichtungszustände einen Einfluss auf die beobachteten Fluoreszenzlebensdauern haben könnten. Um die Auswirkung der Chromatinkompaktierung auf die Lebenszeiten zu messen, haben wir die mittleren DAPI-Lebenszeiten für verschiedene Beispiele von Chromosom 1 (GM18507-Zellen) von einem Objektträger und ihren heteromorphen Regionen mit der gemessenen Chromosomenfläche korreliert. Wie bereits beschrieben, wurden die Lebensdauern für Chromosomenpaare gemittelt, die Pixel entsprechend ihrer Lebensdauer eingefärbt und Regionen mit kurzer Lebensdauer (rote Regionen) als heteromorphe Regionen eingestuft. Die Segmentierung und Analyse der heteromorphen Regionen und die Berechnung der Chromosomenflächen erfolgten mit der Avizo-Software.
Das Diagramm in Abb. 3 zeigt, dass die mittleren Lebensdauern von DAPI für Chromosom 1 und seine heteromorphe Region mit abnehmender Fläche von Chromosom 1 stark abnehmen. In dem Maße, in dem die Fläche eines Chromosoms in einer Ausbreitung die Packungsdichte darstellt, deutet der beobachtete Trend auf eine lineare Abhängigkeit von der Dichte hin, die den Grad der Verdichtung darstellt. Ein ähnlicher Trend wird auch für Chromosomenausbreitungen auf einem anderen Objektträger beobachtet (siehe Abbildung S1).
Mittlere Fluoreszenzlebensdauer von DAPI für verschiedene Chromosomen 1 und ihre heteromorphen Regionen, aufgetragen gegen die Fläche der Chromosomen.
Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Somit ist DAPI sowohl für allgemeine Chromosomenlängenverdichtungen als auch für lokalisierte Subchromosomenkondensationen empfindlich.
Auswirkung der DAPI-Konzentration auf die Lebensdauer
Die mittleren DAPI-Lebensdauern für verschiedene Chromosomen 1 (GM18507-Zellen), die mit unterschiedlichen DAPI-Konzentrationen gefärbt wurden, wurden gemessen, um die Auswirkung der DAPI-Konzentration auf die Lebensdauer zu bestimmen. Zwölf Chromosomen 1 mit annähernd gleicher Fläche vom selben Objektträger wurden für jede Konzentration gemessen.
Aus Tabelle 3 ist ersichtlich, dass die Gesamtintensität von Chromosom 1 mit zunehmender DAPI-Konzentration zunahm. Es wurden jedoch keine signifikanten Unterschiede in der DAPI-Lebensdauer zwischen den verschiedenen Konzentrationen festgestellt.
FLIM von Hoechst 33258, das an fixierte Metaphase-Chromosomen gebunden ist
Um zu bestätigen, dass die von uns beobachteten Schwankungen der Lebensdauer entlang der Chromosomenlänge eine Funktion der Chromatinstruktur sind und nicht auf DAPI-spezifische Effekte zurückzuführen sind, haben wir FLIM mit einem anderen Minor-Groove-Bindungsfarbstoff durchgeführt. Metaphase-Chromosomen (GM18507-Zellen), die in 3:1 Methanol:Essigsäure fixiert waren, wurden mit Hoechst 33258 angefärbt.
Abbildung 4 zeigt das Lebenszeitbild der gemessenen Chromosomenverteilung. Der Fluoreszenzabfall von Hoechst 33258, das an die Chromosomen gebunden ist, weist eine einfach exponentielle Charakteristik auf, ähnlich der von DAPI. Die mittlere Lebensdauer ± SD von Hoechst 33258 für die gemessene Ausbreitung wurde mit 2,42 ± 0,05 ns bestimmt. Die im Vergleich zu den DAPI-gefärbten Chromosomen geringere Standardabweichung (0,12 ns) zeigt, dass die Schwankung der Lebensdauer von Hoechst 33258 über die Ausbreitung nicht so groß ist wie bei den DAPI-gefärbten Chromosomen. Das Bild der Lebensdauer zeigt, dass die heteromorphen Regionen der Chromosomen 1, 9, 15, 16 und Y signifikant kürzere Lebensdauerwerte aufweisen als der Rest der Chromosomen (siehe Abbildung S2 für das mFISH-Bild und den Karyotyp), ähnlich wie bei den DAPI-gefärbten Chromosomen. Die mittlere Lebensdauer ± SD der Hoechst 33258-Moleküle in den heteromorphen Regionen wurde mit 2,36 ± 0,03 ns bestimmt, während die Lebensdauer der Moleküle in den übrigen Chromosomen in der Ausbreitung mit 2,43 ± 0,04 ns bestimmt wurde. Die mittleren Hoechst 33258-Lebensdauerwerte und Standardabweichungen für jede der heteromorphen Regionen der Chromosomen 1, 9, 15, 16 und Y im Vergleich zum Rest des Chromosoms sind in Tabelle S12 aufgeführt.
Lifetime-Bild eines mit Hoechst 33258 gefärbten Chromosoms mit Pfeilen, die die heteromorphen Regionen zeigen (Maßstabsleiste = 10 μm).
Dieses zusätzliche Experiment mit Hoechst bestätigt, dass die entlang der Länge der Chromosomen beobachteten Lebenszeitschwankungen durch die lokale Chromatinstruktur und nicht durch das verwendete Fluorophor verursacht werden.
FLIM von DAPI, das an fixierte Metaphase-Chromosomen aus HeLa-Zellen gebunden ist
FLIM-Messungen an DAPI-gefärbten Metaphase-Chromosomen aus HeLa-Zellen, die in 3:1 Methanol:Essigsäure fixiert wurden, wurden ebenfalls durchgeführt, um zu überprüfen, dass die Variationen in der DAPI-Lebensdauer, die entlang der Länge der Chromosomen beobachtet wurden, nicht nur zelllinienspezifisch sind, sondern auf die allgemeine Chromatinstruktur zurückzuführen sind.
Abbildung 5a zeigt die gemessene Chromosomenausbreitung. Die mittlere Lebensdauer ± SD von DAPI für die gemessene Ausbreitung wurde mit 2,93 ± 0,09 ns bestimmt. Kürzere DAPI-Lebensdauern im Vergleich zum Rest der Chromosomen werden an den heteromorphen Regionen der Chromosomen 1, 9, 15, 16 und Y beobachtet (siehe Abbildung S3 für das mFISH-Bild und den Karyotyp), ähnlich wie bei den GM18507-Zellen. Vier abnorme Chromosomen, die aus einem Teil von Chromosom 1 oder 9 bestehen, wiesen ebenfalls kürzere DAPI-Lebensdauern in ihren perizentromerischen Regionen auf, was darauf schließen lässt, dass sie die heteromorphe Region von Chromosom 1 oder 9 enthalten. Die Verteilungskurven der Lebensdauer mit normalisierten Häufigkeiten für die Regionen mit kurzer Lebensdauer und den Rest der Chromosomen sind in Abb. 5b dargestellt. Die mittlere Lebensdauer der DAPI-Moleküle in den Regionen mit kurzer Lebensdauer wurde mit 2,68 ± 0,08 ns bestimmt, während sie für die Moleküle in den übrigen Chromosomen in der Streuung mit 2,93 ± 0,08 ns bestimmt wurde.
Identifizierung heteromorpher Regionen in Chromosomen aus HeLa-Zellen.
(a) Lifetime-Bild einer Chromosomenausbreitung mit Pfeilen, die die heteromorphen Regionen zeigen. Die in einem gelben gestrichelten Quadrat eingeschlossenen Chromosomen sind die abnormalen Chromosomen (Maßstabsbalken = 10 μm). (b) Normalisierte Lebenszeitverteilungskurven für die heteromorphen Regionen und den Rest der Chromosomen, die kürzere DAPI-Lebensdauern für die heteromorphen Regionen zeigen als für den Rest der Chromosomen.
FLIM von an Interphasen-Chromosomen gebundenem DAPI in fixierten Zellkernen
Die Lebensdauer von an Interphasen-Chromosomen gebundenem DAPI in einem 3:1 Methanol:Essigsäure fixierten Zellkern der GM18507 Lymphozyten-Zelllinie wurde ebenfalls abgebildet, wie in Abb. 6 gezeigt. Ein Z-Stapel des Kerns wurde mit einem konfokalen Mikroskop mit Multiphotonenanregung (bei 760 nm) aufgenommen. Abb. 6a und c zeigen Bilder, die bei -0,50 μm bzw. +0,50 μm von der ursprünglichen Fokusebene (Abb. 6b) aufgenommen wurden.
Ausgewählte Fokusebenen aus dem Z-Stapel der Lebenszeitbilder des Interphasenkerns von GM18507-Zellen bei (a) -0,50 μm, (b) 0 μm und (c) +0.50 μm Fokus (Maßstabsbalken = 5 μm, siehe Abbildung S5 für alle Fokusebenen im Z-Stapel).
Für den DAPI-Fluoreszenzabfall wurde ein einzelner exponentieller Charakter beobachtet. Die Lebenszeitbilder des gemessenen Kerns zeigen, dass die DAPI-Lebensdauer im Interphasenkern stark variiert, wobei lokalisierte Regionen mit kurzen Lebensdauern zu beobachten sind (durch Pfeile in Abb. 6 gekennzeichnet). Auch wenn der fixierte Kern im Vergleich zu seiner ursprünglichen Kugelform durch den Fixierungsprozess etwas kollabiert ist, zeigt dies die Lage der Regionen mit kurzer Lebensdauer in drei Dimensionen. Die 3D-Rekonstruktion der konfokalen z-Stapel-Bilder (siehe Abbildung S4) und die quantitative Analyse der Regionen mit kurzer Lebensdauer wurden mit der Avizo-Software durchgeführt.
Tabelle 4 zeigt das Volumen, die mittlere Lebensdauer und die Position der Regionen mit kurzer Lebensdauer in Bezug auf den Radius des Zellkerns. Die berechneten Volumina für die Regionen mit kurzer Lebensdauer sind größer als das typische Volumen eines Metaphase-Chromosoms (~1-3 um3), was auf eine erhebliche Dekompaktierung des Chromatins in der Interphase hindeutet. Die Positionen der Regionen mit kurzer Lebensdauer wurden berechnet, um festzustellen, ob sie bevorzugt im Zellkern liegen. Aus der Tabelle ist ersichtlich, dass die Regionen mit kurzer Lebensdauer näher an der Peripherie als im Zentrum des Zellkerns liegen. Wir haben in dieser Studie drei Kerne untersucht und festgestellt, dass alle eine ähnliche Verteilung der Regionen mit kurzer Lebensdauer aufweisen (siehe Abbildungen S6 und S7 für die beiden anderen Kerne).
DAPI-gefärbte Interphasen-Chromosomen innerhalb eines Kerns von CCD37LU-Lungenfibroblastenzellen, die in 3:1 Methanol:Essigsäure fixiert wurden, wurden ebenfalls gemessen, wie in Abb. 7a gezeigt. Das Bild zeigt das Vorhandensein von Regionen mit kurzer Lebensdauer innerhalb des Zellkerns, ähnlich wie bei den GM18507 Lymphozytenzellen. Die Regionen mit kurzer Lebensdauer haben jedoch keine bevorzugte Lage innerhalb des Zellkerns. Abbildung 7b zeigt das FISH-Bild des gemessenen Zellkerns. Die Zentromersonde von Chromosom 9 ist im Bild rot dargestellt. Beim Vergleich von Abb. 7a und b ist zu erkennen, dass sich die Position der Chromosom-9-Zentromer-Sonde mit der der beiden Regionen mit kurzer Lebensdauer überschneidet. Ein weiterer gemessener Zellkern zeigt ein ähnliches Ergebnis und ist in Abbildung S8 dargestellt.
FLIM des Interphasenkerns von CCD37LU-Zellen.
(a) Lebenszeitbild des Zellkerns. Die in einem rot gestrichelten Quadrat eingeschlossenen Regionen mit kurzer Lebensdauer wurden als Teil von Chromosom 9 identifiziert (Maßstabsleiste = 5 μm). (b) FISH-Bild des gemessenen Zellkerns, das die Position der Zentromersonde für Chromosom 9 zeigt (Maßstab = 5 μm). Die Lage der Sonde überschneidet sich mit der Lage der eingeschlossenen kurzlebigen Regionen in Abb. 7a.