Polimerase Chain Reaction (PCR) é uma técnica que usa a DNA polimerase para amplificar um único fio ou segmento de DNA. Com o produto final variando de milhares a milhões de cópias de DNA, a PCR é uma parte extremamente importante da pesquisa médica e clínica. Os desenvolvedores, Kary Mullis e Michael Smith, ganharam um Prêmio Nobel de Química por sua contribuição.
Síntese de DNA por PCR tem sido usada para várias aplicações posteriores:
- Isolamento de ADN: Esta técnica permite que segmentos específicos de DNA sejam separados e estudados, como em casos de sequenciamento de DNA ou de impressões digitais genéticas.
- Amplificação: Talvez o uso mais comum, a PCR pode ser usada nas mais pequenas quantidades de ADN recolhido para aumentar a quantidade e tamanho das amostras. Isto é inestimável na análise forense ou histórica do ADN.
- Usos médicos: A técnica é usada em hospitais para testes pré-natais, mapeamento genético, triagem de câncer, tipagem tecidual e terapia de precisão no tratamento de doenças.
- Doença Bacteriana/Viral: Através de testes para DNA específico, certas doenças infecciosas podem ser encontradas exclusivamente através de PCR. Os tecidos também podem ser analisados para expressão gênica, testando doenças específicas.
Metodologia e Processo
Embora haja diferentes métodos usados dependendo do propósito específico do DNA, há um modelo generalizado para PCR. Devido à sensibilidade da contaminação do ADN, a técnica segue um protocolo cuidadoso para permanecer pura.
- Inicialização: Ao usar a PCR de arranque a quente, que é útil na amplificação de tipos específicos de ADN, a câmara de reacção é aquecida a cerca de 200o F durante vários minutos.
- Desnaturação: Em técnicas regulares, isto consiste em elevar a temperatura durante vários segundos para cerca de 200o F para desnaturar os filamentos de ADN, quebrando as ligações de hidrogénio. Isto resulta em dois filamentos de ADN separados, que estão prontos para serem ligados a novos iniciadores.
- Recozimento: A temperatura é diminuída mas ainda assim mantida acima do derretimento para facilitar uma ligação muito específica. Isto permite que os iniciadores se liguem a fios individuais complementares de ADN. A hélice dupla está pronta para formar mais uma vez.
- Extensão: Nesta fase, a DNA polimerase sintetiza um cordão totalmente novo ao estender os primers já disponíveis formados durante a etapa de recozimento. Usando grupos de fosfato dNTP, o cordão é alongado. O número de sequências de ADN deve duplicar. Como o dNTP e a DNA polimerase são usados para cima, ocorre um nível fora do estágio até atingir um platô no qual todos os reagentes e enzimas são esgotados. A quantificação precisa dos produtos PCR pode não ser confiável devido aos diferentes estágios de platô. A criação final de cada produto é considerada um ciclo. O novo ADN é criado exponencialmente em múltiplos ciclos de extensão.
- Alongamento Final: Embora esta etapa não seja necessária, é útil para assegurar que os fios restantes sejam alongados.
- Alongamento Final: A temperatura é resfriada até cerca de 40o F para permitir que os filamentos de DNA recém-sintetizados fiquem totalmente definidos e preparados para armazenamento.
O papel do dNTP
Existem quatro tipos de dNTP, ou trifosfato de desoxinucleótido, cada um usando uma base de DNA diferente: adenina (dATP), citosina (dCTP), guanina (dGTP), e timina (dTTP). Usando dNTP durante a fase de extensão fornece bases únicas prontas para entrar no DNA e duplicá-lo, como blocos de construção.
Desde que o objetivo da técnica é sintetizar o novo DNA, dNTP fornece nucleotídeos para a fita “descompactada” usando o modelo de um único lado. Isto transforma uma única fita de DNA em duas, e pode continuar exponencialmente enquanto os reagentes permanecerem presentes até a fase final de retenção.
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