Gebruik van dNTP in polymerasekettingreactie (PCR) – BioChain Institute Inc.

Polymerase Chain Reaction (PCR) is een techniek waarbij DNA-polymerase wordt gebruikt om een enkele streng of segment van DNA te amplificeren. Met een eindproduct dat kan variëren van duizenden tot miljoenen DNA-kopieën, is PCR een uiterst belangrijk onderdeel van medisch en klinisch onderzoek. De ontwikkelaars, Kary Mullis en Michael Smith, hebben voor hun bijdrage een Nobelprijs voor de scheikunde gekregen.

DNA-synthese door middel van PCR is gebruikt voor verschillende downstream-toepassingen:

• DNA Isolatie: Deze techniek maakt het mogelijk om specifieke segmenten van DNA te scheiden en te bestuderen, zoals in gevallen van DNA-sequencing of genetische fingerprinting.
• Amplificatie: Misschien wel de meest voorkomende toepassing, PCR kan worden gebruikt op de kleinste hoeveelheden verzameld DNA om de hoeveelheid en de grootte van de monsters te vergroten. Dit is van onschatbare waarde bij forensisch of historisch DNA-onderzoek.
• Medisch gebruik: De techniek wordt in ziekenhuizen gebruikt voor prenatale testen, genetische kartering, kankerscreening, weefseltypering en precisietherapie bij de behandeling van ziekten.
• Bacteriële/Virale Ziekte: Door te testen op specifiek DNA, kunnen bepaalde infectieziekten uitsluitend via PCR worden opgespoord. Weefsels kunnen ook worden geanalyseerd op genexpressie, waarbij specifieke ziekten worden getest.

Methodologie en proces

Hoewel er verschillende methoden worden gebruikt, afhankelijk van het specifieke doel van het DNA, is er een algemeen model voor PCR. Vanwege de gevoeligheid van DNA-verontreiniging, volgt de techniek een zorgvuldig protocol om zuiver te blijven.

1. Initialisatie: Bij gebruik van hot-start PCR, die nuttig is voor het amplificeren van specifieke soorten DNA, wordt de reactiekamer eerst gedurende enkele minuten verwarmd tot ongeveer 200o F.
2. Denaturatie: In reguliere technieken bestaat dit uit het verhogen van de temperatuur gedurende enkele seconden tot ongeveer 200o F om de DNA-strengen te denatureren door het verbreken van de waterstofbruggen. Dit resulteert in twee afzonderlijke DNA-strengen, die klaar zijn om aan nieuwe primers te worden gehecht.
3. Uitgloeien: De temperatuur wordt verlaagd, maar nog steeds boven het smeltpunt gehouden om een zeer specifieke binding mogelijk te maken. Hierdoor kunnen primers zich hechten aan complementaire enkelvoudige DNA-strengen. De dubbele helix is klaar om zich opnieuw te vormen.
4. Extensie: In deze fase synthetiseert DNA-polymerase een geheel nieuwe streng door de reeds beschikbare primers die tijdens de annealingstap zijn gevormd te verlengen. Door het gebruik van dNTP-fosfaatgroepen wordt de streng verlengd. Het aantal DNA-sequenties moet verdubbelen. Naarmate dNTP en DNA-polymerase worden opgebruikt, treedt een afvlakkingsfase op totdat een plateau wordt bereikt waarin alle reagentia en enzymen zijn uitgeput. Nauwkeurige kwantificering van PCR-producten kan onbetrouwbaar zijn als gevolg van verschillende plateaufasen. De eindcreatie van elk product wordt als één cyclus beschouwd. Nieuw DNA wordt exponentieel aangemaakt in meerdere extensiecycli.
5. Eindelongatie: Hoewel deze stap niet noodzakelijk is, is het nuttig om ervoor te zorgen dat eventuele resterende strengen worden verlengd.
6. Final Hold: De temperatuur wordt gekoeld tot ongeveer 40o F om pas gesynthetiseerde DNA-strengen in staat te stellen zich volledig te zetten en te worden voorbereid voor opslag.

De rol van dNTP

Er zijn vier soorten dNTP, of deoxynucleotide trifosfaat, waarbij elk een andere DNA base gebruikt: adenine (dATP), cytosine (dCTP), guanine (dGTP), en thymine (dTTP). Het gebruik van dNTP tijdens de extensie-fase levert enkelvoudige basen die klaar zijn om in het DNA te gaan en het te verdubbelen, als bouwstenen.

Aangezien het doel van de techniek is nieuw DNA te synthetiseren, levert dNTP nucleotiden aan de “uitgepakte” streng met behulp van het sjabloon van een enkelvoudige zijde. Dit verandert een enkele streng DNA in twee, en kan exponentieel doorgaan zolang reagentia aanwezig blijven tot de laatste hold-fase.

BioChain’s dNTP Mix Producten

De dNTP producten en mixen die door BioChain worden geleverd, zijn speciaal vervaardigd en getest voor moleculaire biologie toepassingen. Zij kunnen worden gebruikt in PCR, RT-PCR, DNA-labeling, en DNA-sequencing processen. De dNTPs worden gezuiverd met preparatieve HPLC en bezitten een zuiverheid van ten minste 99,5%.

Sterge controlenormen en state-of-the-art technologie garanderen de beste kwaliteit van het product. De concentratie wordt geverifieerd met optische dichtheid spectrofotometrie. De bereiding is zorgvuldig om DNase- en RNase-verontreiniging te voorkomen. Dit wordt vastgesteld door incubatie van de kwaliteit met radioactieve substraten.

Elke partij dNTP wordt ook getest op de prestaties met Taq/Pfu/T7 DNA polymerase en Sequenase. Verder zijn de prestaties van dNTP getest in BioChain’s on-site lab door middel van lange PCR om 15 kb (E. coli DNA-sjabloon) en 30 kb (Lambda DNA-sjabloon) te amplificeren.

Individueel gescheiden base nucleotide mixen zijn beschikbaar, samen met Hotstart Taq DNA polymerase reagentia voor alle PCR behoeften.

BioChain biedt de meest concurrerende prijs op de markt. Korting voor grote hoeveelheden/bulkaankoop is beschikbaar.

Vind meer dNTP producten hier!