La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique qui utilise l’ADN polymérase pour amplifier un seul brin ou segment d’ADN. Avec un produit final allant de milliers à des millions de copies d’ADN, la PCR est un élément extrêmement important de la recherche médicale et clinique. Les développeurs, Kary Mullis et Michael Smith, ont remporté un prix Nobel de chimie pour leur contribution.
La synthèse d’ADN par PCR a été utilisée pour plusieurs applications en aval :
- Isolation d’ADN : Cette technique permet de séparer et d’étudier des segments spécifiques d’ADN, comme dans les cas de séquençage d’ADN ou d’empreintes génétiques.
- Amplification : Peut-être l’utilisation la plus courante, la PCR peut être utilisée sur les plus petites quantités d’ADN recueillies pour augmenter la quantité et la taille des échantillons. Cette technique est précieuse en médecine légale ou en analyse historique de l’ADN.
- Utilisations médicales : Cette technique est utilisée dans les hôpitaux pour les tests prénataux, la cartographie génétique, le dépistage du cancer, le typage des tissus et la thérapie de précision dans le traitement des maladies.
- Maladie bactérienne/virale : En recherchant un ADN spécifique, certaines maladies infectieuses peuvent être trouvées exclusivement par PCR. Les tissus peuvent également être analysés pour l’expression des gènes, testant des maladies spécifiques.
Méthodologie et processus
Bien qu’il existe différentes méthodes utilisées en fonction de l’objectif spécifique de l’ADN, il existe un modèle généralisé de PCR. En raison de la sensibilité de la contamination de l’ADN, la technique suit un protocole minutieux pour rester pur.
- Initialisation : Lors de l’utilisation de la PCR à démarrage à chaud, qui est utile pour amplifier des types spécifiques d’ADN, la chambre de réaction est d’abord chauffée à environ 200o F pendant plusieurs minutes.
- Dénaturation : Dans les techniques habituelles, cela consiste à augmenter la température pendant plusieurs secondes à environ 200o F pour dénaturer les brins d’ADN en brisant les liaisons hydrogène. Il en résulte deux brins d’ADN séparés, qui sont prêts à être attachés à de nouvelles amorces.
- Recuit : La température est diminuée mais toujours maintenue au-dessus de la température de fusion afin de faciliter une liaison très spécifique. Cela permet aux amorces de se fixer à des brins simples d’ADN complémentaires. La double hélice est prête à se former à nouveau.
- Extension : À ce stade, l’ADN polymérase synthétise un brin entièrement nouveau en étendant les amorces déjà disponibles formées lors de l’étape de recuit. En utilisant les groupes phosphate des dNTP, le brin est allongé. Le nombre de séquences d’ADN doit doubler. Au fur et à mesure de l’épuisement des dNTP et de l’ADN polymérase, une étape de palier se produit jusqu’à atteindre un plateau dans lequel tous les réactifs et les enzymes sont épuisés. La quantification précise des produits PCR peut être peu fiable en raison des différents stades de plateau. La création finale de chaque produit est considérée comme un cycle. Le nouvel ADN est créé de manière exponentielle dans des cycles d’extension multiples.
- Elongation finale : Bien que cette étape ne soit pas nécessaire, elle est utile pour s’assurer que tous les brins restants sont allongés.
- Maintien final : La température est refroidie à environ 40o F pour permettre aux brins d’ADN nouvellement synthétisés de se fixer complètement et d’être préparés pour le stockage.
Le rôle des dNTP
Il existe quatre types de dNTP, ou désoxynucléotide triphosphate, chacun utilisant une base différente de l’ADN : adénine (dATP), cytosine (dCTP), guanine (dGTP) et thymine (dTTP). L’utilisation de dNTP pendant la phase d’extension fournit des bases simples prêtes à aller dans l’ADN et à le doubler, comme des blocs de construction.
Comme le but de la technique est de synthétiser un nouvel ADN, le dNTP fournit des nucléotides au brin « dézippé » en utilisant la matrice d’un seul côté. Cela transforme un seul brin d’ADN en deux, et peut continuer de manière exponentielle tant que les réactifs restent présents jusqu’à l’étape finale de maintien.
Produits de mélange de dNTP de BioChain
Les produits et mélanges de dNTP fournis par BioChain sont spécialement fabriqués et testés pour les applications de biologie moléculaire. Ils peuvent être utilisés dans les processus de PCR, RT-PCR, marquage d’ADN et séquençage d’ADN. Les dNTP sont purifiés par HPLC préparative et possèdent une pureté d’au moins 99,5%.
Des normes de contrôle rigoureuses et une technologie de pointe assurent la meilleure qualité du produit. La concentration est vérifiée par spectrophotométrie de densité optique. La préparation est soignée pour éviter toute contamination par la DNase et la RNase. Celle-ci est déterminée par l’incubation de la qualité avec des substrats radioactifs.
Chaque lot de dNTP est également testé pour ses performances avec l’ADN polymérase Taq/Pfu/T7 et la Sequenase. En outre, le dNTP a été testé pour ses performances dans le laboratoire sur site de BioChain par PCR longue pour amplifier 15 kb (matrice d’ADN E. coli) et 30 kb (matrice d’ADN Lambda).
Des mélanges de nucléotides de base séparés individuellement sont disponibles, ainsi que des réactifs d’ADN polymérase Hotstart Taq pour tous les besoins de PCR.
BioChain offre le prix le plus compétitif du marché. Un rabais pour les achats en grande quantité/en vrac est disponible.
Recherchez d’autres produits dNTP ici!