Eksponerede tilstandskarakteristika for fri DAPI og DAPI bundet til DNA
DAPI’s exciterede tilstandslevetid er velkendt26, så vi målte levetiden for ubundet DAPI i PBS-opløsning (pH 7.2) for at bestemme både systemets følsomhed og nøjagtigheden af levetidsmålingerne. Fluorescensfaldet viste en dobbelt eksponentiel karakter: fluorescenslevetidskomponenter, τ, og intensitetskoefficienter, a, er angivet i tabel 1. Værdien af den lange levetidskomponent stemmer godt overens med litteraturen, mens værdien af den korte levetidskomponent er højere end den, der er beskrevet i litteraturen ved pH 7, hvor værdiintervallet er 0,19-0,24 ns26.
Vi målte dernæst levetiden for DAPI bundet til DNA indeholdende forskellige mængder AT- og GC-baser for at bestemme, om DNA-basesammensætningen har nogen indflydelse på DAPI-levetiden. Calf thymus (CT) og micrococcus luteus (ML) DNA blev anvendt til denne del af undersøgelsen på grund af deres forskellige baseparsammensætninger (42% GC for CT DNA og 72% GC for ML DNA). Der blev målt tre opløsninger af hver af CT- og ML-DNA. DAPI-levetiden for hver type DNA udviste to komponenter (tabel 1). Den korte levetidskomponent af DAPI bundet til ML-DNA er lidt højere end den for CT-DNA (130 ps forskel). Der er ikke observeret nogen signifikant forskel mellem de lange levetidskomponenter.
FLIM af DAPI bundet til fikserede metafase-kromosomer fra B-lymfocytter
Figur 1a viser et levetidsbillede af en typisk “spredning” af menneskelige metafase-kromosomer fikseret i 3:1 methanol:eddikesyre (se Metoder for definition af kromosomspredning). Et udvidet billede af det omsluttede område i figuren taget ved en højere pixelopløsning er vist i fig. 1b. Falsk farve bruges til at repræsentere levetidsværdien ved hver billedpixel.
Variationer i DAPI-levetiden langs kromosomernes længde.
Livstidsbilleder af (a) et kromosom spredt (skala bar = 10 μm) og (b) et udvidet billede af det lukkede område i fig. 1a taget med en højere pixelopløsning, der viser kromosom 1 og 9 (skala bar = 2 μm). Figur 1b indsat: Normaliserede DAPI-fluorescensaftagende kurver ved udvalgte pixels fra de røde, grønne og blå områder i kromosom 9 i figur 1b. Området for levetidens farveskala går fra 2,50 ns (rød) til 3,14 ns (blå), som vist.
Både figurer viser, at der er en variation i DAPI’s levetid langs kromosomernes længde. DAPI-fluorescensaftagende kurver med normaliserede intensiteter er også vist i fig. 1b som supplement til billederne af levetiden og viser, at fluorescensen af DAPI-molekylerne i de røde områder har et hurtigere aftagende end i de blå områder. Den gennemsnitlige levetid ± standardafvigelse (SD) for DAPI for den målte kromosomspredning i Fig. 1a blev bestemt til 2,91 ± 0,12 ns; fluorescensaftabet af DAPI viste sig at have en enkelt eksponentiel karakteristik.
Identifikation af heteromorfe regioner i kromosomer
Tolv kromosomspredninger (GM18507-celler) med 46 kromosomer hver blev målt fra tre objektglas. Figur 2a viser et livstidsbillede af en af de målte spredninger. I hver af de målte spredninger fandt vi, at visse kromosomer har specifikke regioner langs deres længde, der har betydeligt kortere levetider end resten af kromosomet, for det meste i nærheden af centromererne. Disse regioner fremstår røde i levetidsbillederne på grund af den anvendte farveskala; vi vil betegne dem som regioner med kort levetid.
Identifikation af heteromorfe regioner i kromosomer.
(a) Levetidsbillede af en kromosomspredning med pile, der viser de heteromorfe regioner (skala bar = 10 μm). (b) Normaliserede levetidsfordelingskurver for de heteromorfe regioner og resten af kromosomerne, der viser kortere DAPI-levetider for de heteromorfe regioner end for resten af kromosomerne. (c) mFISH-billede af den målte kromosomspredning. (d) Karyotyping af kromosomerne i fig. 2a,c baseret på farve.
Livstidsfordelingskurverne med normaliserede frekvenser for de regioner med kort levetid og resten af kromosomerne i fig. 2a er vist i fig. 2b. Den gennemsnitlige levetid ± SD for DAPI-molekyler i regionerne med kort levetid i fig. 2a blev bestemt til at være 2,48 ± 0,13 ns, mens den for molekylerne i resten af kromosomerne i spredningen blev bestemt til 2,80 ± 0,09 ns. Standardafvigelserne repræsenterer, hvor varierede levetidsværdierne er inden for de korte levetidsregioner og resten af kromosomerne for den målte spredning.
Vi mistænkte, at de korte levetidsregioner svarede til heteromorfe regioner i kromosomerne. Sådanne regioner viser variationer i morfologi på specifikke steder, mens de ikke påvirker fænotypen, og de er ofte heterokromatiske af natur. Kendte morfologiske variationer i heteromorfe regioner er blevet forbundet med lang levetid og infertilitet og er derfor af stor interesse i genetiske undersøgelser. Heteromorfe regioner er kendt for at forekomme på kromosomerne 1, 9, 15, 16 og Y-kromosomet27.
Det blev besluttet at udføre mFISH-forsøg (se Metoder) på alle de målte spredninger for at identificere de kromosomer, der indeholder regionerne med kort levetid. MFISH-billedet og karyotypen af spredningen i fig. 2a er vist i henholdsvis fig. 2c,d. De regioner med kortere levetid sammenlignet med resten af kromosomerne i alle de målte spredninger blev identificeret som værende de pericentromeriske regioner af kromosom 1, 9 og 16, den korte arm af kromosom 15 og den distale region af kromosom Y; disse regioner er kendt for at være heteromorfe regioner, hvilket bekræfter vores hypotese.
Tabel 2 viser den gennemsnitlige levetidsværdi af DAPI for hver af de heteromorfe regioner i fig. 2a. Da hvert autosom optræder to gange, blev de gennemsnitlige levetider og standardafvigelser for de heteromorfe regioner, der blev opnået for autosomer med samme kromosomnummer, henholdsvis gennemsnitliggjort og samlet.
Det fremgår af tabellen, at de målte levetider for de heteromorfe regioner på kromosom 1, 16 og Y er ens og er betydeligt længere end for kromosom 9 og 15. Den heteromorfe region på kromosom 9 kan beskrives ved to levetider, således at region 9a har en værdi svarende til den for kromosom 15, mens region 9b har en kortere levetid end region 9a.
De andre målte spredninger (se tabellerne S1-S11 i det supplerende materiale) viser en lignende tendens til, at de heteromorfe regioner på kromosom 9 og 15 har kortere levetider end dem for kromosom 1, 16 og Y.
Trends i DAPI-levetid med kromosomareal
Kromosomer er kendt for at blive gradvist mere kompakte, når de nærmer sig metafase-stadiet i cellecyklus; Colcemid blev anvendt til denne undersøgelse for at blokere cellerne på dette stadium før høstning. Cellerne i den synkroniserede population forventes imidlertid ikke alle at være præcis i samme kondensationsstadie ved høst. Denne variation i komprimeringen afspejles i variationen i det relative areal af et bestemt kromosom fra en kromosomspredning til en anden på det samme objektglas, idet de mere kompakte kromosomer har mindre arealer. Vi forventede, at forskellige komprimeringstilstande kunne have en virkning på de observerede fluorescenslevetider. For at måle virkningen af kromatinkomprimering på levetider korrelerede vi de gennemsnitlige DAPI-levetider for forskellige eksempler på kromosom 1’er (GM18507-celler) fra et objektglas og deres heteromorfe regioner med det målte kromosomareal. Som tidligere beskrevet blev livstidsværdierne for kromosompar gennemsnitliggjort, pixels tildelt en farve i henhold til livstidsværdien, og regioner med kort levetid (røde regioner) blev anset for at være heteromorfe af natur. Segmentering og analyse af de heteromorfe regioner og beregning af kromosomarealerne blev udført ved hjælp af Avizo-softwaren.
Grafikken i fig. 3 viser, at den gennemsnitlige levetid for DAPI for kromosom 1 og dets heteromorfe region falder kraftigt med faldende kromosom 1-areal. I det omfang et kromosoms areal i en spredning repræsenterer pakningstætheden, tyder den observerede tendens på en lineær afhængighed af tætheden, der repræsenterer graden af kondensering. En lignende tendens er også observeret for kromosomspredninger på et andet objektglas (se figur S1).
DAPI’s gennemsnitlige fluorescenslevetid for forskellige kromosom 1’er og deres heteromorfe regioner plottet mod kromosomernes areal.
Fejlestængerne repræsenterer standardafvigelsen. DAPI er således følsomt over for både generelle kromosomlængdekomprimeringer og lokaliseret subkromosomkondensering.
Effekt af DAPI-koncentration på levetiden
Den gennemsnitlige DAPI-levetid for forskellige kromosomer 1’er (GM18507-celler) farvet med forskellige DAPI-koncentrationer blev målt for at bestemme effekten af DAPI-koncentrationen på levetiden. Tolv kromosom 1’er, med omtrent samme areal, fra det samme objektglas blev målt for hver koncentration.
Det fremgår af tabel 3, at den samlede intensitet af kromosom 1 steg, efterhånden som koncentrationen af DAPI blev forøget. Der blev imidlertid ikke observeret nogen signifikant variation i DAPI-levetiden mellem de forskellige koncentrationer.
FLIM af Hoechst 33258 bundet til fikserede metafase-kromosomer
For at bekræfte, at de variationer i levetiden, som vi har observeret langs kromosomernes længde, er en funktion af kromatinstrukturen og ikke skyldes specifikke effekter af DAPI, udførte vi FLIM ved hjælp af et andet farvestof, der binder til mindre riller. Metafase-kromosomer (GM18507-celler) fikseret i 3:1 methanol:eddikesyre blev farvet med Hoechst 33258.
Figur 4 viser et billede af levetiden af den målte kromosomspredning. Fluorescensaftabet af Hoechst 33258 bundet til kromosomerne viste sig at have enkelt eksponentiel karakteristik, svarende til DAPI’s. Den gennemsnitlige levetid ± SD for Hoechst 33258 for den målte spredning blev bestemt til 2,42 ± 0,05 ns. Den mindre standardafvigelse sammenlignet med standardafvigelsen for de DAPI-farvede kromosomer (0,12 ns) viser, at variationen i Hoechst 33258’s levetid på tværs af spredningen ikke er så stor som den, der er observeret for de DAPI-farvede kromosomer. Livstidsbilledet viser, at de heteromorfe regioner af kromosom 1, 9, 15, 16 og Y udviste betydeligt kortere livstidsværdier end resten af kromosomerne (se figur S2 for mFISH-billedet og karyotypen), svarende til det, der blev observeret for de DAPI-færgede kromosomer. Den gennemsnitlige levetid ± SD for Hoechst 33258-molekyler i de heteromorfe regioner blev bestemt til at være 2,36 ± 0,03 ns, mens den for molekylerne i resten af kromosomerne i spredningen blev bestemt til 2,43 ± 0,04 ns. De gennemsnitlige Hoechst 33258-levetidsværdier og standardafvigelser for hver af de heteromorfe regioner af kromosomerne 1, 9, 15, 16 og Y sammenlignet med resten af kromosomet er vist i tabel S12.
Livstidsbillede af en kromosomspredning farvet med Hoechst 33258 med pile, der viser de heteromorfe regioner (skala bar = 10 μm).
Dette yderligere forsøg med Hoechst bekræfter, at de variationer i levetiden, der er observeret langs kromosomernes længde, skyldes den lokale kromatinstruktur og ikke den anvendte fluorofore.
FLIM af DAPI bundet til fikserede metafase-kromosomer fra HeLa-celler
FLIM-målinger på DAPI-farvede metafase-kromosomer fra HeLa-celler fikseret i 3:1 methanol:eddikesyre blev også udført for at verificere, at de variationer i DAPI-levetiden, der observeres langs kromosomernes længde, ikke blot er cellelinjespecifikke, men skyldes den generelle kromatinstruktur.
Figur 5a viser den målte kromosomspredning. Den gennemsnitlige levetid ± SD for DAPI for den målte spredning blev bestemt til 2,93 ± 0,09 ns. Der observeres kortere DAPI-levetider sammenlignet med resten af kromosomerne ved de heteromorfe områder af kromosomerne 1, 9, 15, 16 og Y (se figur S3 for mFISH-billedet og karyotypen), svarende til det, der er observeret for GM18507-cellerne. Fire unormale kromosomer, der består af en del af enten kromosom 1 eller 9, udviste også de kortere DAPI-levetider i deres pericentromeriske regioner, hvilket tyder på, at de indeholder den heteromorfe region af kromosom 1 eller 9. Livstidsfordelingskurverne med normaliserede frekvenser for de regioner med kort levetid og resten af kromosomerne er vist i fig. 5b. Den gennemsnitlige levetid for DAPI-molekylerne i regionerne med kort levetid blev bestemt til at være 2,68 ± 0,08 ns, mens den for molekylerne i resten af kromosomerne i spredningen blev bestemt til 2,93 ± 0,08 ns.
Identificering af heteromorfe regioner i kromosomer fremstillet fra HeLa-celler.
(a) Livstidsbillede af en kromosomspredning med pile, der viser de heteromorfe regioner. De kromosomer, der er omgivet af en gul stiplet firkant, er de unormale kromosomer (skala bar = 10 μm). (b) Normaliserede levetidsfordelingskurver for de heteromorfe regioner og resten af kromosomerne, der viser kortere DAPI-levetider for de heteromorfe regioner end for resten af kromosomerne.
FLIM af DAPI bundet til interfasekromosomer inden for fikserede kerner
Livstiden af DAPI bundet til interfasekromosomer inden for en 3:1 methanol:eddikesyrefikseret kerne fra GM18507-lymfocytcellelinjen blev også afbildet, som vist i fig. 6. Der blev taget et z-stack af kernen ved hjælp af et konfokalt mikroskop med multiphoton excitation (ved 760 nm). Fig. 6a,c viser billeder opnået ved henholdsvis -0,50 μm og +0,50 μm fra det oprindelige fokusplan (fig. 6b).
Udvalgte fokalplaner fra z-stakken af levetidsbillederne af interfasekernen fra GM18507-celler ved (a) -0,50 μm, (b) 0 μm og (c) +0.50 μm fokus (skalaen er 5 μm, se figur S5 for alle fokuseringsplanerne i z-stakken).
Der blev observeret en enkelt eksponentiel karakter for DAPI-fluorescensnedgangen. Livstidsbillederne af den målte kerne viser, at der er en stærk variation i DAPI-levetiden på tværs af interfasekernen, hvor der kan observeres lokaliserede områder med korte levetider (angivet med pile i fig. 6). Selv om den fikserede kerne er noget sammenklappet i forhold til sin oprindelige sfæriske form som følge af fikseringsprocessen, viser dette placeringen af regionerne med kort levetid i tre dimensioner. 3D-rekonstruktion af de konfokale z-stack-billeder (se figur S4) og kvantitativ analyse af regionerne med kort levetid blev udført ved hjælp af Avizo-softwaren.
Tabel 4 viser volumen, gennemsnitlig levetid og placering i forhold til kerneens radius af regionerne med kort levetid. De beregnede volumener for regionerne med kort levetid viser sig at være større end det typiske volumen for et kromosom i metafase (~1-3 um3), hvilket tyder på en betydelig dekomprimering af kromatinet i interfasen. Placeringen af regionerne med kort levetid blev beregnet for at afgøre, om de har præferentielle placeringer i kernen. Det fremgår af tabellen, at regionerne med kort levetid er placeret tættere på periferien end i centrum af kernen. Vi undersøgte tre kerner i denne undersøgelse og fandt, at alle viste en lignende fordeling af regioner med kort levetid (se figur S6 og S7 for de to andre kerner).
DAPI-farvede interfasekromosomer i en kerne fra CCD37LU lungefibroblastceller fikseret i 3:1 methanol:eddikesyre blev også målt, som vist i fig. 7a. Billedet viser tilstedeværelsen af regioner med kort levetid i kernen, svarende til det, der er observeret i GM18507-lymfocytcellerne. De regioner med kort levetid har imidlertid ingen præferentiel placering i kernen. Figur 7b viser FISH-billedet af den målte kerne. Kromosom 9 centromersonden er vist som rød på billedet. Ved sammenligning af figur 7a og 7b kan det konstateres, at placeringen af kromosom 9’s centromersonde overlapper placeringen af de to regioner med kort levetid. En anden målt kerne viser et lignende resultat og er præsenteret i figur S8.
FLIM af interfasekerne fra CCD37LU-celler.
(a) Livstidsbillede af kernen. De regioner med kort levetid, der er omgivet af en rød stiplet firkant, blev identificeret som en del af kromosom 9 (skala bar = 5 μm). (b) FISH-billede af den målte kerne, der viser placeringen af centromersonden for kromosom 9 (skala bar = 5 μm). Placeringen af sonden overlapper med placeringen af de omsluttede regioner med kort levetid i fig. 7a.