5 Reglering av intracellulära anjonkoncentrationer
Kloridreglering beror på samordningen av flera processer (fig. 2). Vissa kloridläckagekanaler har föreslagits minska den intracellulära kloridkoncentrationen genom att fungera som envägsventiler. Denna idé härrör från observationen att kloridkanaler som ClC-2 (gen clcn2) är mer permeabla för klorid som lämnar cellen än för klorid som kommer in i cellen.35 Oavsett denna differentiella permeabilitet, som kallas likriktning, beror kloridflödets riktning fortfarande på kloriddrivkraften. Detta innebär att klorid sällan eller aldrig kommer att ha möjlighet att lämna cellen via ClC-2 eftersom kloriddrivkraften nästan alltid är i motsatt riktning. Eftersom ”ventilen” är ofullständig låter ClC-2-kanalerna faktiskt klorid läcka in i cellen.36
Det faktum att kanalerna inte lyckas släppa ut klorid ur cellen belyser behovet av olika jontransportmekanismer som kan förflytta klorid mot gradienten.37 Kotransportörer, eller symportörer, förflyttar två eller flera jonsorter i samma riktning över cellmembranet; klorid kan förflytta sig mot gradienten genom att följa med en annan jon som förflyttar sig nedåt i gradienten. Utbytare, eller antiporters, gör i praktiken samma sak, men genom att koppla ihop rörelsen av jonarter som flyter i motsatt riktning genom membranet. Den viktigaste kloridextruderaren i neuroner är kaliumkloridkotransporter 2 (KCC2) (genen slc12a5). KCC2 låter klorid följa med kaliumjoner som flödar nerför gradienten och ut ur cellen. Processen är elektroneutral på grund av stökiometrin 1:1 mellan klorid och kalium. Processen är inte aktiv i den mån den inte direkt inbegriper hydrolys av ATP (och därför bör den inte kallas pumpning); i stället är processen sekundärt aktiv eftersom KCC2 förlitar sig på kaliumgradienten som upprätthålls av natrium-kalium ATPaset, som pumpar in kalium i cellen.
Natrium-kaliumklorid-kotransporter 1 eller NKCC1 (genen slc12a2) är en annan viktig bidragande faktor till den neuronala kloridhomeostasen. NKCC1 utnyttjar natriumgradienten för att flytta kalium och klorid in i cellen, vilket resulterar i en hög intracellulär kloridkoncentration. Detta är naturligtvis motsatsen till hur KCC2 påverkar klorid. Det relativa uttrycket av NKCC1 och KCC2 dikterar således den intracellulära kloridkoncentrationen, trots effekterna av kloridbelastning genom olika kloridkanaler, inklusive aktiverade GABAA- och glycin-kanaler. Flera punkter bör noteras. För det första uttrycks NKCC1 starkt tidigt i utvecklingen medan KCC2 endast uttrycks svagt, men det sker en utvecklingsomställning som leder till det omvända mönstret i vuxen ålder.38,39 I ryggmärgens dorsalhorn hos råttan tycks Eanion nå sitt mogna värde omkring två veckor efter födseln,40 men full kapacitet för kloridextrusion uppnås inte förrän 3-4 veckor efter födseln41; med andra ord överväldigar kloridbelastningen lättare den KCC2-medierade kloridextrusionen i unga neuroner. För det andra sker inte utvecklingsskiftet i primära afferenta neuroner, vilket innebär att NKCC1-nivåerna förblir höga, vilket resulterar i höga intracellulära kloridkoncentrationer i dessa celler42,43 . För det tredje uttrycks NKCC1 och KCC2 inte ens enhetligt inom ett enda neuron, vilket kan leda till hög intracellulär klorid i ett kompartment (t.ex. axonets initiala segment) och låg intracellulär klorid i andra kompartment (t.ex. soma och dendriter).44,45 Och slutligen kan de normala vuxna nivåerna av KCC2-uttryck förändras patologiskt (avsnitt 8).
Det måste nämnas något om hur elektrofysiologiska inspelningar utförs, eftersom detta (avsiktligt eller oavsiktligt) kan leda till förändringar i den intracellulära kloridkoncentrationen. Med helcells patch clamp-tekniken bryts cellmembranet för att få elektrisk tillgång till cellen efter det att patchpipetten har förseglats mot cellmembranet; följaktligen dialyseras cytosolen med pipettlösningen. Pipettlösningen är ofta utformad så att den har en kloridkoncentration som närmar sig den naturliga intracellulära nivån, men ibland har den medvetet en hög kloridkoncentration för att öka kloriddrivkraften (t.ex. för att underlätta detektering av små hämmande postsynaptiska strömmar). Båda tillvägagångssätten är acceptabla beroende på vilken fråga som ställs. Men i båda fallen innebär dialysering av cellen att den intracellulära kloridnivån i praktiken är begränsad till eller nära kloridnivån i pipettlösningen, vilket naturligtvis inte är lämpligt för att mäta den naturliga kloridnivån i cellen. Detta problem kan lösas genom att använda tekniken med perforerade plåster.46 Med detta sagt kan dialysering av cellen användas för att testa extruderingskapaciteten genom att bestämma om den intracellulära kloridkoncentrationen är i jämvikt med pipettkoncentrationen eller om cellen lyckas upprätthålla en lägre nivå på grund av sina extruderingsmekanismer.47,48 Vid spänningsklampning förändras dessutom membranpotentialen plötsligt och hålls på godtyckligt valda värden, vilket kan leda till mycket onaturliga kloriddrivkrafter. Som Ratté och Prescott förklarar,36 måste sådana experimentella detaljer övervägas noggrant för att undvika feltolkningar.
Som redan nämnts strömmar bikarbonat ut genom aktiverade GABAA- och glycinreceptorer. Sannolikheten för att bikarbonatutflöde orsakar extracellulär ackumulering är låg med tanke på den relativt obegränsade spridningen av bikarbonat i det extracellulära utrymmet, men bikarbonatutflöde kan tömma de intracellulära bikarbonatnivåerna och orsaka en pH-sänkning49. Detta tenderar dock att inte inträffa under normala förhållanden eftersom intracellulärt bikarbonat fylls på genom omvandling av koldioxid och vatten till bikarbonat och protoner med hjälp av enzymet karbonanhydras; som gas diffunderar koldioxid fritt genom cellmembranet. Intracellulärt bikarbonat kan utarmas (och dess utflöde därmed begränsas) genom blockering av kolsyraanhydras med acetazolamid32 , som faktiskt kan ha analgetiska effekter (avsnitt 9). Reglering av pH innebär andra kemiska reaktioner och transportmekanismer, och bikarbonat självt kan transporteras över cellmembranet i utbyte mot klorid.50
.