Reacția în lanț a polimerazei (PCR) este o tehnică care utilizează ADN polimeraza pentru a amplifica un singur șir sau segment de ADN. Cu un produs final care variază de la mii la milioane de copii de ADN, PCR este o parte extrem de importantă a cercetării medicale și clinice. Dezvoltatorii, Kary Mullis și Michael Smith, au câștigat un premiu Nobel pentru chimie pentru contribuția lor.
Sinteza ADN-ului prin PCR a fost utilizată pentru mai multe aplicații în aval:
- Izolarea ADN: Această tehnică permite separarea și studierea unor segmente specifice de ADN, cum ar fi în cazurile de secvențiere a ADN-ului sau de amprentare genetică.
- Amplificare: Poate cea mai comună utilizare, PCR poate fi folosită pe cele mai mici cantități de ADN colectate pentru a crește cantitatea și dimensiunea probelor. Acest lucru este de neprețuit în criminalistică sau în analiza istorică a ADN-ului.
- Utilizări medicale: Tehnica este utilizată în spitale pentru testarea prenatală, cartografierea genetică, depistarea cancerului, tipizarea țesuturilor și terapia de precizie în tratamentul bolilor.
- Bolile bacteriene/virale: Prin testarea ADN-ului specific, anumite boli infecțioase pot fi depistate exclusiv prin PCR. Țesuturile pot fi, de asemenea, analizate pentru expresia genelor, testând boli specifice.
Metodologie și proces
În timp ce există diferite metode utilizate în funcție de scopul specific al ADN-ului, există un șablon generalizat pentru PCR. Din cauza sensibilității contaminării ADN-ului, tehnica urmează un protocol atent pentru a rămâne pură.
- Inițializare: Atunci când se utilizează PCR cu pornire la cald, care este utilă în amplificarea unor tipuri specifice de ADN, camera de reacție este mai întâi încălzită la aproximativ 200o F timp de câteva minute.
- Denaturare: În tehnicile obișnuite, aceasta constă în ridicarea temperaturii timp de câteva secunde la aproximativ 200o F pentru a denatura șirurile de ADN prin ruperea legăturilor de hidrogen. Acest lucru are ca rezultat două șiruri de ADN separate, care sunt gata să se atașeze la noi primeri.
- Recoacere: Temperatura este scăzută, dar menținută în continuare peste temperatura de topire pentru a facilita o legare foarte specifică. Acest lucru permite ca amorsele să se atașeze la șiruri unice complementare de ADN. Dublul helix este gata să se formeze din nou.
- Prelungire: În această etapă, ADN polimeraza sintetizează un șir complet nou prin extinderea amorselor deja disponibile formate în timpul etapei de recoacere. Prin utilizarea grupărilor fosfat dNTP, șirul este alungit. Numărul de secvențe de ADN ar trebui să se dubleze. Pe măsură ce se consumă dNTP și ADN polimeraza, are loc o etapă de nivelare până când se ajunge la un platou în care toți reactivii și enzimele sunt epuizați. Este posibil ca cuantificarea precisă a produselor PCR să nu fie fiabilă din cauza diferitelor stadii de platou. Crearea finală a fiecărui produs este considerată un ciclu. Noul ADN este creat exponențial în mai multe cicluri de extensie.
- Alungire finală: Deși această etapă nu este necesară, este utilă pentru a se asigura că orice șiruri rămase sunt alungite.
- Menținerea finală: Temperatura este răcită la aproximativ 40o F pentru a permite ca șirurile de ADN nou sintetizate să se fixeze complet și să fie pregătite pentru depozitare.
Rolul dNTP
Există patru tipuri de dNTP, sau trifosfat de deoxinucleotidă, fiecare folosind o bază diferită a ADN-ului: adenină (dATP), citozină (dCTP), guanină (dGTP) și timină (dTTP). Folosirea dNTP în timpul fazei de extensie furnizează baze simple gata să intre în ADN și să îl dubleze, ca niște blocuri de construcție.
Din moment ce scopul tehnicii este de a sintetiza ADN nou, dNTP furnizează nucleotide la șirul „desfăcut” folosind șablonul unei singure laturi. Acest lucru transformă o singură catenă de ADN în două, și poate continua exponențial atâta timp cât reactivii rămân prezenți până la etapa finală de menținere.
Produsele dNTP Mix de la BioChain
Produsele și amestecurile dNTP furnizate de BioChain sunt fabricate și testate special pentru aplicații de biologie moleculară. Acestea pot fi utilizate în procesele PCR, RT-PCR, de marcare a ADN-ului și de secvențiere a ADN-ului. DNTP-urile sunt purificate cu HPLC preparativ și posedă o puritate de cel puțin 99,5%.
Standardele de control riguroase și tehnologia de ultimă generație asigură cea mai bună calitate a produsului. Concentrația este verificată prin spectrofotometrie de densitate optică. Prepararea este atentă pentru a evita contaminarea cu DNază și RNază. Aceasta se determină prin incubarea calității cu substraturi radioactive.
Care lot de dNTP este, de asemenea, testat pentru performanță cu ADN polimeraza Taq/Pfu/T7 și Sequenase. Mai mult, dNTP a fost testată performanța în laboratorul de la fața locului al BioChain prin PCR lung pentru a amplifica 15 kb (șablon ADN E. coli) și 30 kb (șablon ADN Lambda).
Sunt disponibile amestecuri de nucleotide de bază separate individual, împreună cu reactivi de ADN polimerază Hotstart Taq pentru toate nevoile PCR.
BioChain oferă cel mai competitiv preț de pe piață. Sunt disponibile reduceri pentru achiziții în cantități mari/în vrac.
Găsește mai multe produse dNTP aici!