Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest techniką, która wykorzystuje polimerazę DNA do amplifikacji pojedynczej nici lub segmentu DNA. Dzięki temu, że produkt końcowy zawiera od tysięcy do milionów kopii DNA, PCR jest niezwykle ważną częścią badań medycznych i klinicznych. Twórcy metody, Kary Mullis i Michael Smith, otrzymali za swój wkład Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii.
Synteza DNA poprzez PCR została wykorzystana w kilku dalszych zastosowaniach:
- Izolacja DNA: Technika ta pozwala na oddzielenie i badanie specyficznych segmentów DNA, jak w przypadku sekwencjonowania DNA lub genetycznego fingerprintingu.
- Amplifikacja: Być może najczęstsze zastosowanie, PCR może być stosowany na najmniejszych ilościach zebranego DNA, aby zwiększyć ilość i wielkość próbek. Jest to nieocenione w kryminalistyce lub historycznej analizie DNA.
- Zastosowania medyczne: Technika ta jest stosowana w szpitalach do badań prenatalnych, mapowania genetycznego, badań przesiewowych nowotworów, typowania tkanek i terapii precyzyjnej w leczeniu chorób.
- Choroby bakteryjne/wirusowe: Poprzez badanie specyficznego DNA, niektóre choroby zakaźne mogą być znalezione wyłącznie poprzez PCR. Tkanki można również analizować pod kątem ekspresji genów, badając konkretne choroby.
Metodologia i proces
Choć istnieją różne metody stosowane w zależności od konkretnego celu DNA, istnieje uogólniony szablon do PCR. Ze względu na wrażliwość zanieczyszczenia DNA, technika podąża za starannym protokołem, aby pozostać czystym.
- Inicjalizacja: Podczas używania gorącego startu PCR, który jest przydatny w amplifikacji specyficznych rodzajów DNA, komora reakcyjna jest najpierw podgrzewana do około 200o F przez kilka minut.
- Denaturacja: W zwykłych technikach polega to na podniesieniu temperatury na kilka sekund do około 200o F w celu denaturacji nici DNA przez zerwanie wiązań wodorowych. Powoduje to powstanie dwóch oddzielnych nici DNA, które są gotowe do przyłączenia do nowych starterów.
- Wyżarzanie: Temperatura jest obniżona, ale nadal utrzymywana powyżej topnienia w celu ułatwienia bardzo specyficznego wiązania. Pozwala to primerom na przyłączenie się do komplementarnych pojedynczych nici DNA. Podwójna helisa jest gotowa do ponownego utworzenia.
- Rozszerzenie: Na tym etapie polimeraza DNA syntetyzuje całkowicie nową nić poprzez przedłużenie już dostępnych starterów utworzonych podczas etapu annealingu. Dzięki zastosowaniu grup fosforanowych dNTP, nić ulega wydłużeniu. Liczba sekwencji DNA powinna się podwoić. W miarę zużywania się dNTP i polimerazy DNA następuje etap wyrównywania, aż do osiągnięcia plateau, w którym wszystkie odczynniki i enzymy zostają wyczerpane. Dokładna kwantyfikacja produktów PCR może być niewiarygodna z powodu różnych etapów plateau. Końcowe tworzenie każdego produktu jest uważane za jeden cykl. Nowe DNA jest tworzone wykładniczo w wielu cyklach przedłużania.
- Końcowa elongacja: Chociaż ten krok nie jest konieczny, jest przydatny, aby zapewnić, że wszelkie pozostałe pasma są wydłużone.
- Końcowe zatrzymanie: Temperatura jest schładzana do około 40o F, aby pozwolić nowo zsyntetyzowanym niciom DNA w pełni ustabilizować się i być przygotowanym do przechowywania.
Rola dNTP
Są cztery rodzaje dNTP, lub trifosforanu deoksynukleotydu, z których każdy używa innej zasady DNA: adenina (dATP), cytozyna (dCTP), guanina (dGTP), i tymina (dTTP). Użycie dNTP w fazie przedłużania dostarcza pojedyncze zasady gotowe do wejścia do DNA i podwojenia go, jak bloki budulcowe.
Ponieważ celem techniki jest synteza nowego DNA, dNTP dostarcza nukleotydy do „rozpakowanej” nici przy użyciu szablonu pojedynczej strony. To zmienia pojedynczą nić DNA w dwie i może być kontynuowane wykładniczo tak długo, jak długo odczynniki pozostają obecne aż do końcowego etapu wstrzymania.
Produkty mieszanki dNTP firmy BioChain
Produkty i mieszanki dNTP dostarczane przez BioChain są specjalnie produkowane i testowane do zastosowań w biologii molekularnej. Mogą być stosowane w procesach PCR, RT-PCR, znakowania DNA i sekwencjonowania DNA. DNTPs są oczyszczane przy użyciu preparatywnej HPLC i posiadają co najmniej 99,5% czystości.
Rygorystyczne standardy kontroli i najnowocześniejsza technologia zapewniają najwyższą jakość produktu. Stężenie jest weryfikowane za pomocą spektrofotometrii gęstości optycznej. Przygotowanie jest staranne, aby uniknąć zanieczyszczenia DNazą i RNazą. Jest to określane przez inkubację jakości z substratami radioaktywnymi.
Każda partia dNTP jest również testowana pod kątem wydajności z polimerazą DNA Taq/Pfu/T7 i Sequenase. Ponadto, dNTP zostały przetestowane w laboratorium BioChain na miejscu, poprzez długi PCR w celu amplifikacji 15 kb (szablon DNA E. coli) i 30 kb (szablon DNA Lambda).
Indywidualnie rozdzielone mieszanki nukleotydów bazowych są dostępne wraz z odczynnikami polimerazy Hotstart Taq DNA dla wszystkich potrzeb PCR.
BioChain oferuje najbardziej konkurencyjną cenę na rynku. Rabat dla dużych ilości / zakupu hurtowego jest dostępny.
Znajdź więcej produktów dNTP tutaj!