ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、DNAポリメラーゼを用いて、DNAの一本鎖または断片を増幅する技術です。 最終的には数千から数百万のDNAコピーを生成するため、PCRは医学および臨床研究において非常に重要な役割を担っています。 開発者のKary MullisとMichael Smithは、その貢献によりノーベル化学賞を受賞した。

PCRによるDNA合成は、いくつかの下流用途に使用されている。

  • DNAの単離。 この技術により、DNAの配列決定や遺伝的指紋採取の場合など、DNAの特定のセグメントを分離して研究することができる。
  • 増幅（Amplification）。 おそらく最も一般的な使用法で、PCRは採取したごく少量のDNAに対して使用し、サンプルの量とサイズを増やすことができます。 これは法医学や歴史的なDNA分析において非常に貴重である。
  • 医学的な使用法。 この技術は、病院で出生前検査、遺伝子マッピング、がん検診、組織タイピング、病気治療における精密治療などに利用されている。
  • 細菌・ウイルス性疾患。 特定のDNAを検査することで、ある種の感染症はPCRによって独占的に見つけることができる。 また、組織の遺伝子発現を解析することで、特定の疾患を検査することができる。

Methodology and Process

DNAの目的によって方法は異なりますが、PCRには一般的なテンプレートが存在します。 DNAの汚染に敏感なため、この技術は純度を保つために慎重なプロトコルに従います。

  1. 初期化。 特定の種類のDNAを増幅するのに有効なホットスタートPCRを用いる場合、まず反応槽を約200o Fに数分間加熱する。
  2. Denaturation：変性。 通常の技術では、温度を約200℃まで数秒間上昇させ、水素結合を切断することによってDNAの鎖を変性させる。 この結果、2本の別々のDNA鎖ができ、新しいプライマーと結合する準備が整う。
  3. アニーリング。 温度は下がるが、融点以上の温度を保ち、非常に特異的な結合を促進する。 これにより、プライマーはDNAの相補的な一本鎖に結合することができる。 二重らせんを再び形成する準備が整う。
  4. 伸長。 この段階では、DNAポリメラーゼは、アニーリングステップで形成された既に利用可能なプライマーを延長することによって、全く新しい鎖を合成する。 dNTPのリン酸基を利用することにより、鎖は伸長される。 DNA配列の数は2倍になるはずである。 dNTPとDNAポリメラーゼを使い切ると、試薬と酵素を使い切るプラトーに達するまで、レベルオフの段階が発生する。 PCR産物の正確な定量はプラトーの段階が異なるために信頼できない場合がある。 各生成物の最終的な生成は1サイクルとみなされる。 新しいDNAは複数回の伸長サイクルで指数関数的に作られる。
  5. Final Elongation（最終伸長）。 このステップは必要ないが、残っている鎖を確実に伸長させるために有効である。
  6. Final Hold：新しく合成されたDNA鎖が完全に固まり、保存の準備ができるように、温度を約40℃まで下げます。

dNTPの役割

dNTP（デオキシヌクレオチド三リン酸）は、アデニン（dATP）、シトシン（dCTP）、グアニン（dGTP）、チミン（dTTP）という4種類があり、それぞれが異なるDNA塩基を使用するものである。 伸長段階でdNTPを使用すると、DNAに入る準備ができている一塩基が、積み木のように二重になります。

この技術の目的は新しいDNAを合成することなので、dNTPは片方をテンプレートにして「解凍」した鎖にヌクレオチドを供給します。

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