Uso del dNTP nella reazione a catena della polimerasi (PCR) – BioChain Institute Inc.

La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnica che utilizza la DNA polimerasi per amplificare un singolo filamento o segmento di DNA. Con il prodotto finale che va da migliaia a milioni di copie di DNA, la PCR è una parte estremamente importante della ricerca medica e clinica. Gli sviluppatori, Kary Mullis e Michael Smith, hanno vinto un premio Nobel per la chimica per il loro contributo.

La sintesi del DNA tramite PCR è stata utilizzata per diverse applicazioni a valle:

• Isolamento del DNA: Questa tecnica permette di separare e studiare specifici segmenti di DNA, come nel caso del sequenziamento del DNA o del fingerprinting genetico.
• Amplificazione: Forse l’uso più comune, la PCR può essere usata sulle più piccole quantità di DNA raccolte per aumentare la quantità e la dimensione dei campioni. Questo è inestimabile nella medicina legale o nell’analisi storica del DNA.
• Usi medici: La tecnica è usata negli ospedali per test prenatali, mappatura genetica, screening del cancro, tipizzazione dei tessuti e terapia di precisione nel trattamento delle malattie.
• Malattia batterica/virale: Testando il DNA specifico, alcune malattie infettive possono essere trovate esclusivamente attraverso la PCR. I tessuti possono anche essere analizzati per l’espressione genica, testando malattie specifiche.

Metodologia e processo

Mentre ci sono diversi metodi usati a seconda dello scopo specifico del DNA, c’è un modello generalizzato di PCR. A causa della sensibilità della contaminazione del DNA, la tecnica segue un protocollo accurato per rimanere pura.

1. Inizializzazione: Quando si usa la PCR a caldo, che è utile per amplificare specifici tipi di DNA, la camera di reazione viene prima riscaldata a circa 200o F per diversi minuti.
2. Denaturazione: Nelle tecniche normali, questo consiste nell’aumentare la temperatura per diversi secondi a circa 200o F per denaturare i filamenti di DNA rompendo i legami idrogeno. Questo si traduce in due filamenti di DNA separati, che sono pronti ad attaccarsi a nuovi primer.
3. Ricottura: La temperatura viene diminuita ma mantenuta al di sopra della fusione per facilitare un legame molto specifico. Questo permette ai primer di attaccarsi a singoli filamenti complementari di DNA. La doppia elica è di nuovo pronta a formarsi.
4. Estensione: In questa fase, la DNA polimerasi sintetizza un filamento completamente nuovo estendendo i primer già disponibili formati durante la fase di annealing. Utilizzando i gruppi fosfato dNTP, il filamento viene allungato. Il numero di sequenze di DNA dovrebbe raddoppiare. Man mano che il dNTP e la DNA polimerasi si esauriscono, si verifica una fase di livellamento fino a raggiungere un plateau in cui tutti i reagenti e gli enzimi sono esauriti. La quantificazione precisa dei prodotti di PCR può essere inaffidabile a causa delle diverse fasi di plateau. La creazione finale di ogni prodotto è considerata un ciclo. Il nuovo DNA viene creato esponenzialmente in più cicli di estensione.
5. Allungamento finale: Anche se questo passaggio non è necessario, è utile per garantire che tutti i filamenti rimanenti siano allungati.
6. Mantenimento finale: La temperatura viene raffreddata a circa 40o F per consentire ai filamenti di DNA appena sintetizzati di impostarsi completamente ed essere preparati per la conservazione.

Il ruolo del dNTP

Ci sono quattro tipi di dNTP, o deossinucleotide trifosfato, ognuno dei quali utilizza una diversa base del DNA: adenina (dATP), citosina (dCTP), guanina (dGTP) e timina (dTTP). L’uso del dNTP durante la fase di estensione fornisce basi singole pronte a entrare nel DNA e a raddoppiarlo, come dei mattoni.

Siccome lo scopo della tecnica è quello di sintetizzare nuovo DNA, il dNTP fornisce nucleotidi al filamento “decompresso” usando il template di un singolo lato. Questo trasforma un singolo filamento di DNA in due, e può continuare in modo esponenziale finché i reagenti rimangono presenti fino alla fase finale di mantenimento.

I prodotti dNTP Mix di BioChain

I prodotti dNTP e le miscele fornite da BioChain sono prodotti e testati appositamente per le applicazioni di biologia molecolare. Possono essere utilizzati nei processi di PCR, RT-PCR, etichettatura del DNA e sequenziamento del DNA. I dNTP sono purificati con HPLC preparativo e possiedono almeno il 99,5% di purezza.

Standard di controllo rigorosi e tecnologia all’avanguardia garantiscono la migliore qualità del prodotto. La concentrazione è verificata mediante spettrofotometria a densità ottica. La preparazione è attenta ad evitare la contaminazione da DNasi e RNasi. Ciò è determinato dall’incubazione della qualità con substrati radioattivi.

Ogni lotto di dNTP è anche testato per le prestazioni con Taq/Pfu/T7 DNA polymerase e Sequenase. Inoltre, il dNTP è stato testato nel laboratorio on-site di BioChain tramite PCR lunga per amplificare 15 kb (template del DNA di E. coli) e 30 kb (template del DNA di Lambda).

Sono disponibili miscele di nucleotidi a basi separate singolarmente, insieme ai reagenti Hotstart Taq DNA polimerasi per tutte le esigenze della PCR.

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