A dNTP használata a polimeráz láncreakcióban (PCR) – BioChain Institute Inc.

A polimeráz láncreakció (PCR) egy olyan technika, amely DNS-polimerázt használ a DNS egyetlen szálának vagy szegmensének felerősítésére. Mivel a végtermék több ezer és több millió DNS-kópia között mozog, a PCR rendkívül fontos része az orvosi és klinikai kutatásoknak. A fejlesztők, Kary Mullis és Michael Smith, közreműködésükért kémiai Nobel-díjat kaptak.

A PCR segítségével történő DNS-szintézist számos downstream alkalmazásban használják:

• DNS-izolálás: Ez a technika lehetővé teszi a DNS meghatározott szegmenseinek elkülönítését és tanulmányozását, például DNS-szekvenálás vagy genetikai ujjlenyomatok készítése esetén.
• Amplifikáció: Talán a leggyakoribb felhasználási mód, a PCR a begyűjtött DNS legkisebb mennyiségénél is alkalmazható a minták mennyiségének és méretének növelésére. Ez felbecsülhetetlen értékű a kriminalisztikában vagy a történelmi DNS-elemzésben.
• Orvosi felhasználás: A technikát a kórházakban prenatális vizsgálatokra, genetikai térképezésre, rákszűrésre, szövettipizálásra és precíziós terápiára használják a betegségek kezelésében.
• Bakteriális/vírusos betegségek: A specifikus DNS vizsgálatával bizonyos fertőző betegségek kizárólag PCR segítségével kimutathatók. A szövetek génexpressziója is elemezhető, specifikus betegségeket tesztelve.

Módszertan és folyamat

Míg a DNS konkrét céljától függően eltérő módszereket alkalmaznak, a PCR-nek van egy általános sablonja. A DNS-szennyezés érzékenysége miatt a technika gondos protokollt követ, hogy tiszta maradjon.

1. Inicializálás: A hot-start PCR alkalmazásakor, amely bizonyos DNS-fajták amplifikálásához hasznos, a reakcióteret először néhány percig körülbelül 200o F-ra melegítjük.
2. Denaturálás: A szokásos technikáknál ez abból áll, hogy a hőmérsékletet néhány másodpercre körülbelül 200o F-ra emeljük, hogy a DNS-szálakat a hidrogénkötések felbontásával denaturáljuk. Ez két különálló DNS-szálat eredményez, amelyek készen állnak az új primerekhez való kapcsolódásra.
3. Lágyítás: A hőmérsékletet csökkentik, de még mindig az olvadás felett tartják, hogy megkönnyítsék a nagyon specifikus kötődést. Ez lehetővé teszi, hogy a primerek komplementer egyszálú DNS-szálakhoz kapcsolódjanak. A kettős spirál ismét készen áll a kialakulásra.
4. Hosszabbítás: Ebben a szakaszban a DNS-polimeráz egy teljesen új szálat szintetizál a már rendelkezésre álló, a lágyítási lépés során képződött primerek meghosszabbításával. A dNTP foszfátcsoportok segítségével a szál megnyúlik. A DNS-szekvenciák számának meg kell duplázódnia. A dNTP és a DNS-polimeráz elhasználódásával egy kiegyenlítődési szakasz következik be, amíg el nem éri a platót, amelyben minden reagens és enzim kimerül. A PCR-termékek pontos mennyiségi meghatározása megbízhatatlan lehet a különböző platófázisok miatt. Az egyes termékek létrehozásának végét egy ciklusnak tekintjük. Az új DNS exponenciálisan jön létre több hosszabbítási ciklusban.
5. Végső megnyúlás: Bár ez a lépés nem szükséges, hasznos annak biztosítása érdekében, hogy a fennmaradó szálak megnyúljanak.
6. Végső tartás: A hőmérsékletet 40o F körüli hőmérsékletre hűtjük, hogy az újonnan szintetizált DNS-szálak teljesen megszilárduljanak és előkészítsük őket a tárolásra.

A dNTP szerepe

Négyféle dNTP, azaz dezoxinukleotid-trifoszfát létezik, mindegyik más DNS-bázist használ: adenin (dATP), citozin (dCTP), guanin (dGTP) és timin (dTTP). A dNTP használata a hosszabbítási fázisban egyetlen bázist biztosít, amely készen áll arra, hogy a DNS-be kerüljön, és megduplázza azt, mint az építőelemek.

Mivel a technika célja új DNS szintetizálása, a dNTP nukleotidokat biztosít a “kibontott” szálhoz az egyetlen oldal sablonját használva. Ezáltal az egyetlen DNS-szálból kettő lesz, és exponenciálisan folytatódhat mindaddig, amíg a reagensek jelen vannak a végső tartási szakaszig.

BioChain dNTP-keverék termékei

A BioChain által biztosított dNTP-termékek és keverékek kifejezetten molekuláris biológiai alkalmazásokhoz készültek és teszteltek. Felhasználhatók PCR, RT-PCR, DNS-jelölési és DNS-szekvenálási folyamatokban. A dNTP-ket preparatív HPLC-vel tisztítják, és legalább 99,5%-os tisztasággal rendelkeznek.

A szigorú ellenőrzési szabványok és a legmodernebb technológia biztosítja a termék legjobb minőségét. A koncentrációt optikai sűrűség spektrofotometriával ellenőrizzük. Az előkészítés gondosan történik a DNáz és RNáz szennyeződés elkerülése érdekében. Ezt a minőség radioaktív szubsztrátokkal történő inkubálással határozzák meg.

Minden dNTP-tétel teljesítményét Taq/Pfu/T7 DNS-polimerázzal és Sequenase-szal is tesztelik. Továbbá a dNTP teljesítményét a BioChain helyszíni laboratóriumában 15 kb (E. coli DNS sablon) és 30 kb (Lambda DNS sablon) felerősítésére irányuló hosszú PCR-rel tesztelték.

Egyenként elkülönített bázisú nukleotidkeverékek, valamint Hotstart Taq DNS-polimeráz reagensek állnak rendelkezésre minden PCR-szükséglethez.

A BioChain a legversenyképesebb árat kínálja a piacon. Nagy mennyiség/tömeges vásárlás esetén kedvezményt biztosítunk.

További dNTP termékeket itt talál!