Vapaan DAPI:n ja DNA:han sitoutuneen DAPI:n innostuneen tilan ominaisuudet
DAPI:n innostuneen tilan elinaika tunnetaan hyvin26, joten mittasimme sitoutumattoman DAPI:n eliniän PBS-liuoksessa (pH 7.2) määrittääksemme sekä järjestelmän herkkyyden että elinaikamittausten tarkkuuden. Fluoresenssin hajoaminen oli luonteeltaan kaksoiseksponentiaalista: fluoresenssin eliniän komponentit τ ja intensiteettikertoimet a on ilmoitettu taulukossa 1. Pitkän elinaikakomponentin arvo vastaa hyvin kirjallisuuden arvoja, kun taas lyhyen elinaikakomponentin arvo on korkeampi kuin kirjallisuudessa kuvattu arvo pH 7:ssä, jossa arvoalue on 0,19-0,24 ns26.
Seuraavaksi mittasimme eri määriä AT- ja GC-emäksisiä DNA:ta sisältävään DNA:han sitoutuneen DAPI:n elinajat selvittääksemme, vaikuttaako DNA:n emäskoostumus DAPI:n elinajan pituuteen. Tutkimuksen tässä osassa käytettiin vasikan kateenkorvan (CT) ja micrococcus luteuksen (ML) DNA:ta niiden erilaisten emäsparikoostumusten vuoksi (42 % GC CT-DNA:ssa ja 72 % GC ML-DNA:ssa). Kummastakin CT- ja ML-DNA:sta mitattiin kolme liuosta. Kummankin DNA-tyypin DAPI:n elinajoissa oli kaksi komponenttia (taulukko 1). ML-DNA:han sitoutuneen DAPI:n lyhyt elinaikakomponentti on hieman suurempi kuin CT-DNA:n (130 ps ero). Pitkien elinaikakomponenttien välillä ei havaittu merkittävää eroa.
FLIM of DAPI B-lymfosyyttien fiksoituihin metafaasikromosomeihin sitoutuneen DAPI:n FLIM of Fixed Metaphase Chromosomes from B-Lymphocytes
Kuvassa 1 a on esitetty elinaikakuva tyypillisestä ”levikkeestä” ihmisen metafaasikromosomeista, jotka on fiksoitu metanoliin:etikkahappo 3:1 (ks. Menetelmissä oleva määritelmä: Kromosomilevike). Kuvassa 1b on esitetty laajennettu kuva kuvaan suljetusta alueesta, joka on otettu suuremmalla pikseliresoluutiolla. Väärää väriä käytetään kuvaamaan eliniän arvoa kussakin kuvapikselissä.
DAPI:n eliniän vaihtelut kromosomien pituutta pitkin.
Lifetime-kuvat (a) kromosomin levityksestä (mittakaavapalkki = 10 μm) ja (b) laajennettu kuva kuvan 1a suljetulta alueelta, joka on otettu suuremmalla pikseliresoluutiolla ja jossa näkyvät kromosomit 1 ja 9 (mittakaavapalkki = 2 μm). Kuva 1b sisäkuva: normalisoidut DAPI:n fluoresenssin hajoamiskäyrät kromosomin 9 punaisen, vihreän ja sinisen alueen valituissa pikseleissä kuvassa 1b. Elinajan väriasteikon vaihteluväli on 2,50 ns:stä (punainen) 3,14 ns:iin (sininen), kuten kuvassa on esitetty.
Kummastakin kuvasta näkyy, että DAPI:n eliniässä on vaihtelua kromosomien pituutta pitkin. Kuvassa 1b on esitetty myös DAPI:n fluoresenssin hajoamiskäyrät normalisoiduilla intensiteeteillä, jotka täydentävät elinaikakuvia ja osoittavat, että DAPI-molekyylien fluoresenssi hajoaa punaisilla alueilla nopeammin kuin sinisillä alueilla. DAPI:n keskimääräinen elinaika ± standardipoikkeama (SD) kuvan 1a mitatulle kromosomilevitykselle määritettiin 2,91 ± 0,12 ns; DAPI:n fluoresenssin hajoamisella todettiin olevan yksittäinen eksponentiaalinen ominaispiirre.
Heteromorfisten alueiden tunnistaminen kromosomeissa
Kolmesta objektilasista mitattiin 12 kromosomilevitystä (GM18507-soluista), joissa kussakin oli 46 kromosomia. Kuvassa 2a on elinikäinen kuva yhdestä mitatusta levikkeestä. Jokaisessa mitatussa levikkeessä havaittiin, että tietyillä kromosomeilla on pituudeltaan erityisiä alueita, joiden elinikä on huomattavasti lyhyempi kuin kromosomin muilla osilla, useimmiten sentromeerien läheisyydessä. Nämä alueet näkyvät elinaikakuvissa punaisina käytetyn väriskaalan vuoksi; kutsumme niitä lyhyen eliniän alueiksi.
Heteromorfisten alueiden tunnistaminen kromosomeissa.
(a) Elinaikakuva kromosomilevityksestä, jossa on nuolet, jotka kuvaavat heteromorfisia alueita (mittakaavaviopalkki = 10 μm). (b) Heteromorfisten alueiden ja muiden kromosomien normalisoidut elinaikajakaumakäyrät, joista käy ilmi, että heteromorfisten alueiden DAPI-elinaika on lyhyempi kuin muiden kromosomien. (c) mFISH-kuva mitatusta kromosomijakaumasta. (d) Kuvien 2a,c kromosomien karyotyypitys värin perusteella.
Kuvassa 2b on esitetty elinaikajakaumakäyrät normalisoituine frekvensseineen kuvan 2a lyhyiden elinaikojen alueille ja muille kromosomeille. DAPI-molekyylien keskimääräiseksi elinajaksi ± SD lyhytaikaisilla alueilla kuvassa 2a määritettiin 2,48 ± 0,13 ns, kun taas muiden kromosomien molekyylien elinajaksi hajonnassa määritettiin 2,80 ± 0,09 ns. Keskihajonnat kuvaavat sitä, kuinka vaihtelevia eliniän arvot ovat lyhyen eliniän alueilla ja muissa kromosomeissa mitatussa hajonnassa.
Epäilimme, että lyhyen eliniän alueet vastasivat heteromorfisia alueita kromosomeissa. Tällaisilla alueilla esiintyy morfologian vaihtelua tietyissä paikoissa, vaikka ne eivät vaikuta fenotyyppiin, ja ne ovat usein luonteeltaan heterokromaattisia. Heteromorfisten alueiden tunnetut morfologiset vaihtelut on yhdistetty pitkäikäisyyteen ja hedelmättömyyteen, joten ne ovat erittäin kiinnostavia geneettisissä tutkimuksissa. Heteromorfisia alueita tiedetään esiintyvän kromosomeissa 1, 9, 15, 16 ja Y-kromosomissa27.
Päädyttiin tekemään mFISH-kokeita (ks. Menetelmät) kaikille mitatuille levinneisyyksille niiden kromosomien tunnistamiseksi, jotka sisälsivät lyhyen eliniän alueet. Kuvassa 2a esitetyn leviämisen mFISH-kuva ja karyotyyppi on esitetty kuvissa 2c,d. Muihin kromosomeihin verrattuna lyhyemmän eliniän omaavat alueet kaikissa mitatuissa leviämissä tunnistettiin kromosomien 1, 9 ja 16 perisentromeerisiksi alueiksi, kromosomin 15 lyhyeksi käsivarreksi ja kromosomin Y distaaliseksi alueeksi; näiden alueiden tiedetään olevan heteromorfisia alueita, mikä vahvistaa hypoteesimme.
Taulukossa 2 on esitetty DAPI:n keskimääräiset eliniän pituuden arvot kullekin kuvassa 2a esitetylle heteromorfiselle alueelle. Koska kukin autosomi esiintyy kahdesti, saman kromosominumeron omaaville autosomeille saadut heteromorfisten alueiden keskimääräiset elinaika-arvot ja standardipoikkeamat keskiarvoistettiin ja yhdistettiin.
Taulukosta voidaan havaita, että kromosomien 1, 16 ja Y heteromorfisten alueiden mitatut elinajat ovat samankaltaisia ja huomattavasti pidempiä kuin kromosomien 9 ja 15. Kromosomin 9 heteromorfista aluetta voidaan kuvata kahdella eliniällä siten, että alueella 9a on samanlainen arvo kuin kromosomissa 15, kun taas alueella 9b on lyhyempi elinaika kuin alueella 9a.
Muut mitatut leviämiset (ks. taulukot S1-S11 oheismateriaalissa) osoittavat samanlaisen trendin, jonka mukaan kromosomien 9 ja 15 heteromorfisilla alueilla on lyhyemmät eliniät kuin kromosomeilla 1, 16 ja Y.
Trendejä DAPI:n elinajan ja kromosomien pinta-alan välillä
Kromosomien tiedetään muuttuvan asteittain tiiviimmiksi, kun ne lähestyvät solusyklin metafaasivaihetta; tässä tutkimuksessa käytettiin kolkemidiä solujen estämiseksi tässä vaiheessa ennen keräämistä. Synkronoidun populaation solujen ei kuitenkaan odoteta olevan kaikki täsmälleen samassa tiivistymisvaiheessa sadonkorjuun yhteydessä. Tämä tiivistymisen vaihtelu näkyy tietyn kromosomin suhteellisen pinta-alan vaihteluna kromosomilevityksestä toiseen samalla objektilasilla, jolloin tiiviimpien kromosomien pinta-alat ovat pienempiä. Odotimme, että erilaisilla tiivistymistiloilla voisi olla vaikutusta havaittuihin fluoresenssin kestoaikoihin. Mitataksemme kromatiinin tiivistymisen vaikutusta elinaikoihin korreloimme DAPI:n keskimääräisiä elinaikoja eri esimerkkien kromosomi 1:n (GM18507-solut) yhdestä objektilasista ja niiden heteromorfisista alueista mitatun kromosomin pinta-alan kanssa. Kuten aiemmin kuvattiin, kromosomiparien elinaika-arvot keskiarvoistettiin, pikseleille annettiin väri elinaika-arvon mukaan ja lyhyet elinaika-alueet (punaiset alueet) katsottiin heteromorfisiksi. Heteromorfisten alueiden segmentointi ja analyysi sekä kromosomien pinta-alojen laskeminen suoritettiin Avizo-ohjelmistolla.
Kuvan 3 kuvaajasta käy ilmi, että DAPI:n keskimääräiset elinajat kromosomissa 1 ja sen heteromorfisella alueella vähenevät voimakkaasti kromosomin 1 pinta-alan pienentyessä. Siinä määrin kuin kromosomin pinta-ala levityksessä edustaa pakkaustiheyttä, havaittu suuntaus viittaa lineaariseen riippuvuuteen tiheydestä, joka edustaa tiivistymisastetta. Samanlainen trendi on havaittu myös kromosomilevityksissä toisessa objektilasissa (ks. kuva S1).
DAPI:n keskimääräiset fluoresenssiaikajaksot eri kromosomi 1:n ja niiden heteromorfisten alueiden kohdalla piirrettyinä kromosomien pinta-alan funktiona.
Virhepalkit kuvaavat standardipoikkeamaa. Näin ollen DAPI on herkkä sekä yleisille kromosomin pituuden tihentymille että paikallisille subkromosomien tihentymille.
DAPI-konsentraation vaikutus elinaikaan
Mittaamalla DAPI:n keskimääräisiä elinaikoja eri DAPI-pitoisuuksilla värjätyille erilaisille kromosomille 1’s:n kromosomeille (GM18507-soluissa) selvitettiin, mikä vaikutus on kromosomien 1’s-kromosomeilla. Kullekin konsentraatiolle mitattiin 12 kromosomi 1:tä, joiden pinta-ala oli suunnilleen sama, samasta objektilasista.
Taulukosta 3 voidaan havaita, että kromosomi 1:n kokonaisintensiteetti kasvoi DAPI-konsentraation kasvaessa. DAPI:n elinajassa ei kuitenkaan havaittu merkittävää vaihtelua eri pitoisuuksien välillä.
FLIM of Hoechst 33258 Bound to Fixed Metaphase Chromosomes
Vahvistaaksemme, että havaitsemamme elinaikavaihtelut kromosomien pituutta pitkin ovat kromatiinirakenteen funktio eivätkä johdu mistään DAPI:lle ominaisista vaikutuksista, suoritimme FLIM:n käyttämällä toista pientä uraa sitovaa väriainetta. Metafaasikromosomit (GM18507-solut), jotka oli kiinnitetty 3:1 metanoli:etikkahappo-suhteessa, värjättiin Hoechst 33258:lla.
Kuvassa 4 on esitetty elinaikakuva mitatusta kromosomien leviämisestä. Kromosomeihin sitoutuneen Hoechst 33258:n fluoresenssin hajoamisen havaittiin olevan yhden eksponentiaalisen ominaisuuden omaavaa, samanlaista kuin DAPI:n. Hoechst 33258:n keskimääräiseksi elinajaksi ± SD mitatun leviämisen osalta määritettiin 2,42 ± 0,05 ns. Pienempi keskihajonta verrattuna DAPI-värjättyjen kromosomien keskihajontaan (0,12 ns) osoittaa, että Hoechst 33258:n elinajan vaihtelu ei ole niin suurta kuin DAPI-värjättyjen kromosomien kohdalla. Elinajan kuva osoittaa, että kromosomien 1, 9, 15, 16 ja Y heteromorfisilla alueilla oli huomattavasti lyhyemmät elinajan arvot kuin muilla kromosomeilla (ks. mFISH-kuva ja karyotyyppi kuvassa S2), samoin kuin DAPI-värjätyillä kromosomeilla havaittiin. Heteromorfisilla alueilla olevien Hoechst 33258 -molekyylien keskimääräiseksi elinajaksi ± SD määritettiin 2,36 ± 0,03 ns, kun taas muissa kromosomeissa levinneiden molekyylien elinajaksi määritettiin 2,43 ± 0,04 ns. Taulukossa S12 esitetään Hoechst 33258 -elinaikojen keskiarvot ja standardipoikkeamat kromosomien 1, 9, 15, 16 ja Y kullakin heteromorfisella alueella verrattuna muihin kromosomeihin.
Lifetime-kuva Hoechst 33258:lla värjätystä kromosomilevystä, jossa nuolet osoittavat heteromorfiset alueet (mittakaavapalkki = 10 μm).
Tämä Hoechstiä käyttävä lisäkoe vahvistaa, että kromosomien pituussuunnassa havaitut elinajan vaihtelut johtuvat paikallisesta kromatiinirakenteesta eikä käytetystä fluorofoorista.
FLIM of DAPI Bound to Fixed Metaphase Chromosomes from HeLa Cells
FLIM-mittaukset DAPI-värjätyille metafaasikromosomeille, jotka on saatu HeLa-soluista, jotka on kiinnitetty 3:1 metanoli:etikkahappo-suhteessa, suoritettiin myös, jotta voitiin varmistua siitä, että DAPI:n eliniän keston aikana havaitut kromosomien pituussuunnassa havaitut DAPI:n elinaikavaihtelut eivät ole pelkkiä solulinjakohtaisia, vaan ne johtuvat yleisestä kromatiinista.
Kuvassa 5a esitetään mitattu kromosomien leviäminen. DAPI:n keskimääräiseksi eliniäksi ± SD mitatun leviämisen osalta määritettiin 2,93 ± 0,09 ns. Muihin kromosomeihin verrattuna lyhyempi DAPI:n elinikä havaitaan kromosomien 1, 9, 15, 16 ja Y heteromorfisilla alueilla (ks. mFISH-kuva ja karyotyyppi kuvassa S3), samoin kuin GM18507-soluissa havaittiin. Neljässä epänormaalissa kromosomissa, jotka koostuvat joko kromosomin 1 tai 9 osasta, havaittiin myös lyhyempi DAPI-elinaika niiden perisentromerisilla alueilla, mikä viittaa siihen, että ne sisältävät kromosomin 1 tai 9 heteromorfisen alueen. Elinaikajakaumakäyrät ja normalisoidut frekvenssit lyhyiden elinaikojen alueille ja muille kromosomeille esitetään kuvassa 5b. Lyhyen eliniän alueilla olevien DAPI-molekyylien keskimääräiseksi eliniäksi määritettiin 2,68 ± 0,08 ns, kun taas levinneisyyden muissa kromosomeissa olevien molekyylien eliniäksi määritettiin 2,93 ± 0,08 ns.
Heteromorfisten alueiden tunnistaminen kromosomeista, jotka on saatu HeLa-soluista.
(a) Elinkaarikuva kromosomilevityksestä, jossa nuolet osoittavat heteromorfiset alueet. Keltaisen katkoviivoitetun neliön ympäröimät kromosomit ovat epänormaaleja kromosomeja (mittakaavapalkki = 10 μm). (b) Heteromorfisten alueiden ja muiden kromosomien normalisoidut elinaikajakaumakäyrät, joista käy ilmi, että heteromorfisten alueiden DAPI-elinaika on lyhyempi kuin muiden kromosomien. Ytimestä otettiin z-pino käyttäen konfokaalimikroskooppia, jossa käytettiin monifotonivalotusta (760 nm:ssä). Kuvissa 6a,c esitetään kuvat, jotka on otettu -0,50 μm:n ja +0,50 μm:n etäisyydeltä alkuperäisestä polttotasosta (kuva 6b).
Valitut polttotasot GM18507-solujen interfaasiytimen elinaikakuvien z-pinosta (a) -0,50 μm:n kohdalla, (b) 0 μm:n kohdalla ja (c) +0.50 μm:n fokus (mittakaavapalkit = 5 μm, ks. kuva S5 kaikkien z-pinon polttotasojen osalta).
DAPI:n fluoresenssin hajoamisessa havaittiin yksi eksponentiaalinen merkki. Mitatun ytimen elinaikakuvat osoittavat, että DAPI:n eliniässä on voimakasta vaihtelua koko interfaasiytimen alueella, jossa voidaan havaita lyhyiden elinaikojen paikallisia alueita (merkitty nuolilla kuvassa 6). Vaikka kiinnitetty tuma on kiinnitysprosessin seurauksena jonkin verran romahtanut verrattuna sen luonnolliseen pallomaiseen muotoon, tämä osoittaa lyhyiden elinaikojen alueiden sijainnit kolmiulotteisesti. Konfokaalisten z-stack-kuvien 3D-rekonstruktio (ks. kuva S4) ja lyhyen elinajan alueiden kvantitatiivinen analyysi tehtiin Avizo-ohjelmistolla.
Taulukossa 4 esitetään lyhyen elinajan alueiden tilavuus, keskimääräinen elinikä ja sijainti suhteessa ytimen säteeseen. Lyhyen eliniän alueiden lasketut tilavuudet ovat suurempia kuin metafaasikromosomin tyypillinen tilavuus (~1-3 um3), mikä viittaa kromatiinin huomattavaan pakkautumiseen interfaasissa. Lyhyen eliniän alueiden sijainnit laskettiin sen määrittämiseksi, onko niillä ensisijaisia sijainteja ytimessä. Taulukosta voidaan havaita, että lyhyen eliniän alueet sijaitsevat lähempänä periferiaa kuin tuman keskustaa. Tarkastelimme tässä tutkimuksessa kolmea ydintä ja havaitsimme, että kaikissa näkyi samanlainen lyhyen elinajan alueiden jakauma (ks. kuvat S6 ja S7 kahdesta muusta ytimestä).
Määritettiin myös DAPI:lla värjäytyneet interfaasikromosomit ytimessä, joka oli peräisin 3:1 metanoliin ja etikkahappoon fiksoiduista keuhkofibroblastisoluista, jotka oli kiinnitetty 3:1 metanoliin ja etikkahappoon, ja se on nähtävillä kuviossa 7a. Kuvassa näkyy lyhytaikaisia alueita tuman sisällä, jotka ovat samanlaisia kuin GM18507-lymfosyyttisoluissa havaitut alueet. Lyhyen eliniän alueilla ei kuitenkaan ole ensisijaista sijaintia tuman sisällä. Kuvassa 7b on FISH-kuva mitatusta ytimestä. Kromosomi 9:n sentromeerikoetin näkyy kuvassa punaisena. Kun verrataan kuvia 7a,b, voidaan havaita, että kromosomi 9:n sentromeerikoettimen sijainti on päällekkäinen kahden lyhyen elinajan alueen kanssa. Toinen mitattu tuma osoittaa samanlaista tulosta, ja se on esitetty kuvassa S8.
FLIM of interphase nucleus from CCD37LU cells.
(a) Elinkaarikuva ytimestä. Punaisen katkoviivoitetun neliön ympäröimät lyhyen elinajan alueet tunnistettiin osaksi kromosomia 9 (mittakaavapalkki = 5 μm). (b) FISH-kuva mitatusta ytimestä, jossa näkyy kromosomin 9 sentromeerikoettimen sijainti (mittakaavapalkki = 5 μm). Koettimen sijainti on päällekkäinen kuvassa 7a olevien suljettujen lyhyen eliniän alueiden sijainnin kanssa.