El uso de imágenes de fluorescencia de DAPI para investigar la condensación de la cromatina en los cromosomas humanos

Características del estado de excitación del DAPI libre y del DAPI unido al ADN

El tiempo de vida del estado de excitación del DAPI es bien conocido26, por lo que medimos el tiempo de vida del DAPI no unido en una solución de PBS (pH 7.2) para determinar tanto la sensibilidad del sistema como la precisión de las mediciones del tiempo de vida. El decaimiento de la fluorescencia mostró un carácter doblemente exponencial: los componentes del tiempo de vida de la fluorescencia, τ y los coeficientes de intensidad, a, se reportan en la Tabla 1. El valor del componente de tiempo de vida largo concuerda bien con la literatura, mientras que el valor del componente de tiempo de vida corto es mayor que el descrito en la literatura a pH 7, donde el rango de valores es de 0,19-0,24 ns26.

A continuación medimos los tiempos de vida del DAPI unido al ADN que contiene diferentes cantidades de bases AT y GC para determinar si la composición de las bases del ADN tiene algún efecto sobre el tiempo de vida del DAPI. Para esta parte del estudio se utilizó ADN de timo de ternera (CT) y de micrococcus luteus (ML) debido a sus diferentes composiciones de pares de bases (42% GC para el ADN CT y 72% GC para el ADN ML). Se midieron tres soluciones de ADN CT y ML. Los tiempos de vida del DAPI para cada tipo de ADN mostraron dos componentes (Tabla 1). El componente de vida corta del DAPI unido al ADN ML es ligeramente superior al del ADN CT (130 ps de diferencia). No se observan diferencias significativas entre los componentes de tiempo de vida largo.

FLIM de DAPI unido a cromosomas metafásicos fijos de linfocitos B

La figura 1a muestra una imagen de tiempo de vida de un «esparcimiento» típico de cromosomas metafásicos humanos fijados en metanol:ácido acético 3:1 (véase la definición de esparcimiento cromosómico en los métodos). En la Fig. 1b se muestra una imagen ampliada de la región incluida en la figura, tomada a una mayor resolución de píxeles. Se utiliza un color falso para representar el valor de la vida útil en cada píxel de la imagen.

Ambas figuras muestran que hay una variación en el tiempo de vida de DAPI a lo largo de los cromosomas. Las curvas de decaimiento de la fluorescencia de DAPI con intensidades normalizadas también se presentan en la Fig. 1b para complementar las imágenes de tiempo de vida y muestran que la fluorescencia de las moléculas de DAPI en las regiones rojas tiene un decaimiento más rápido que la de las regiones azules. La vida media ± desviación estándar (SD) de DAPI para la extensión cromosómica medida en la Fig. 1a se determinó que era de 2,91 ± 0,12 ns; el decaimiento de la fluorescencia de DAPI resultó tener una característica exponencial simple.

Identificación de regiones heteromórficas en cromosomas

Doce extensiones cromosómicas (células GM18507) con 46 cromosomas cada una se midieron a partir de tres portaobjetos. La figura 2a muestra una imagen de vida de uno de los extendidos medidos. En cada una de las extensiones medidas encontramos que ciertos cromosomas tienen regiones específicas a lo largo de sus longitudes que tienen tiempos de vida significativamente más cortos que el resto del cromosoma, sobre todo en las proximidades de los centrómeros. Estas regiones aparecen en rojo en las imágenes de tiempo de vida debido a la escala de colores utilizada; nos referiremos a ellas como regiones de vida corta.

Las curvas de distribución de vida con frecuencias normalizadas para las regiones de vida corta y el resto de los cromosomas en la Fig. 2a se muestran en la Fig. 2b. La vida media ± SD de las moléculas de DAPI en las regiones de vida corta en la Fig. 2a se determinó que era de 2,48 ± 0,13 ns mientras que la de las moléculas en el resto de los cromosomas en la distribución se determinó que era de 2,80 ± 0,09 ns. Las desviaciones estándar representan la variación de los valores de vida dentro de las regiones de vida corta y el resto de los cromosomas para la dispersión medida.

Sospechamos que las regiones de vida corta corresponden a regiones heteromórficas en los cromosomas. Dichas regiones muestran variaciones en la morfología en lugares específicos sin afectar al fenotipo y suelen ser de naturaleza heterocromática. Las variaciones morfológicas conocidas de las regiones heteromórficas se han asociado con la longevidad y la infertilidad, por lo que son de gran interés en los estudios genéticos. Se sabe que las regiones heteromórficas se dan en los cromosomas 1, 9, 15, 16 y en el cromosoma Y27.

Se decidió realizar experimentos de mFISH (ver Métodos) en todos los extendidos medidos para identificar los cromosomas que contienen las regiones de vida corta. La imagen mFISH y el cariotipo de la extensión de la Fig. 2a se muestran en la Fig. 2c,d, respectivamente. Las regiones que muestran tiempos de vida más cortos, en comparación con el resto de los cromosomas, en todos los extendidos medidos se identificaron como las regiones pericentroméricas de los cromosomas 1, 9 y 16, el brazo corto del cromosoma 15 y la región distal del cromosoma Y; se sabe que estas regiones son regiones heteromórficas, lo que confirma nuestra hipótesis.

La tabla 2 muestra el valor de vida media de DAPI para cada una de las regiones heteromórficas de la Fig. 2a. Como cada autosoma aparece dos veces, los tiempos de vida medios y las desviaciones estándar para las regiones heteromórficas obtenidas para los autosomas con el mismo número de cromosoma fueron promediados y agrupados, respectivamente.

Se puede observar en la tabla que los tiempos de vida medidos para las regiones heteromórficas de los cromosomas 1, 16 e Y son similares y son significativamente más largos que los de los cromosomas 9 y 15. La región heteromórfica del cromosoma 9 puede describirse con dos tiempos de vida, de modo que la región 9a tiene un valor similar al del cromosoma 15, mientras que la región 9b tiene un tiempo de vida más corto que el de la región 9a.

Las otras extensiones medidas (véanse las Tablas S1-S11 en los Materiales Complementarios) muestran una tendencia similar de que las regiones heteromórficas de los cromosomas 9 y 15 tienen tiempos de vida más cortos que los de los cromosomas 1, 16 e Y.

Tendencias en el tiempo de vida de DAPI con el área cromosómica

Se sabe que los cromosomas se vuelven progresivamente más compactos a medida que se acercan a la etapa de metafase del ciclo celular; para este estudio se utilizó Colcemid para bloquear las células en esta etapa antes de la recolección. Sin embargo, no se espera que todas las células de la población sincronizada se encuentren exactamente en la misma fase de condensación en el momento de la recolección. Esta variación en la compactación se refleja en la variación del área relativa de un cromosoma en particular de una extensión cromosómica a otra en el mismo portaobjetos, teniendo los cromosomas más compactos áreas más pequeñas. Anticipamos que los diferentes estados de compactación podrían tener un efecto en los tiempos de vida de la fluorescencia observados. Para medir el efecto de la compactación de la cromatina en los tiempos de vida, correlacionamos los tiempos de vida medios de DAPI para varios ejemplos de cromosomas 1 (células GM18507) de un portaobjetos y sus regiones heteromórficas con el área cromosómica medida. Como se ha descrito anteriormente, se promediaron los valores de vida de los pares de cromosomas, se asignó un color a los píxeles según el valor de vida y se consideró que las regiones de vida corta (regiones rojas) eran de naturaleza heteromórfica. La segmentación y el análisis de las regiones heteromórficas y el cálculo de las áreas cromosómicas se llevaron a cabo utilizando el software Avizo.

El gráfico de la Fig. 3 muestra que los tiempos de vida medios de DAPI para el cromosoma 1 y su región heteromórfica disminuyen fuertemente con la disminución del área del cromosoma 1. En la medida en que el área de un cromosoma en una extensión representa la densidad de empaquetamiento, la tendencia observada sugiere una dependencia lineal de la densidad, que representa el grado de condensación. También se observa una tendencia similar para las extensiones de cromosomas en otro portaobjetos (véase la Figura S1).

Efecto de la concentración de DAPI en el tiempo de vida

Se midieron los tiempos de vida medios de DAPI para varios cromosomas 1 (células GM18507) teñidos con diferentes concentraciones de DAPI para determinar el efecto de la concentración de DAPI en el tiempo de vida. Se midieron doce cromosomas 1, con aproximadamente la misma área, del mismo portaobjetos para cada concentración.

Se puede observar en la Tabla 3 que la intensidad total del cromosoma 1 aumentó a medida que se incrementaba la concentración de DAPI. Sin embargo, no se observó ninguna variación significativa en el tiempo de vida del DAPI entre las diferentes concentraciones.

FLIM de Hoechst 33258 unido a cromosomas metafásicos fijos

Para confirmar que las variaciones del tiempo de vida que hemos observado a lo largo de los cromosomas es una función de la estructura de la cromatina y no se debe a ningún efecto específico del DAPI, llevamos a cabo FLIM utilizando otro colorante de unión a ranuras menores. Los cromosomas en metafase (células GM18507) fijados en metanol:ácido acético 3:1 se tiñeron con Hoechst 33258.

La figura 4 muestra la imagen de vida de la extensión cromosómica medida. El decaimiento de la fluorescencia de Hoechst 33258 unido a los cromosomas resultó tener características exponenciales simples, similares a las del DAPI. Se determinó que la vida media ± SD de Hoechst 33258 para la dispersión medida era de 2,42 ± 0,05 ns. La menor desviación estándar, en comparación con la de los cromosomas teñidos con DAPI (0,12 ns), muestra que la variación del tiempo de vida de Hoechst 33258 a lo largo de la extensión no es tan alta como la observada para los cromosomas teñidos con DAPI. La imagen de tiempo de vida muestra que las regiones heteromórficas de los cromosomas 1, 9, 15, 16 e Y mostraron valores de tiempo de vida significativamente más cortos que el resto de los cromosomas (véase la Figura S2 para la imagen mFISH y el cariotipo), similar a lo observado para los cromosomas teñidos con DAPI. La vida media ± SD de las moléculas de Hoechst 33258 en las regiones heteromórficas se determinó que era de 2,36 ± 0,03 ns, mientras que la de las moléculas en el resto de los cromosomas en la dispersión se determinó que era de 2,43 ± 0,04 ns. Los valores de vida media de Hoechst 33258 y las desviaciones estándar para cada una de las regiones heteromórficas de los cromosomas 1, 9, 15, 16 e Y, en comparación con el resto del cromosoma, se presentan en la Tabla S12.

Este experimento adicional con Hoechst confirma que las variaciones del tiempo de vida observadas a lo largo de los cromosomas son causadas por la estructura local de la cromatina y no por el fluoróforo utilizado.

FLIM de DAPI unido a cromosomas metafásicos fijados de células HeLa

También se realizaron mediciones deFLIM en cromosomas metafásicos teñidos con DAPI obtenidos de células HeLa fijadas en metanol 3:1:ácido acético para verificar que las variaciones en el tiempo de vida de DAPI observadas a lo largo de los cromosomas no son sólo específicas de la línea celular sino que se deben a la estructura general de la cromatina.

La Figura 5a muestra la dispersión cromosómica medida. Se determinó que la vida media ± SD de DAPI para la dispersión medida era de 2,93 ± 0,09 ns. Se observan tiempos de vida de DAPI más cortos, en comparación con el resto de los cromosomas, en las regiones heteromórficas de los cromosomas 1, 9, 15, 16 e Y (véase la Figura S3 para la imagen de mFISH y el cariotipo), de forma similar a lo observado en las células GM18507. Cuatro cromosomas anormales que consisten en una parte del cromosoma 1 o 9 también mostraron los tiempos de vida DAPI más cortos en sus regiones pericentroméricas, lo que sugiere que contienen la región heteromórfica del cromosoma 1 o 9. Las curvas de distribución de vida con frecuencias normalizadas para las regiones de vida corta y el resto de los cromosomas se muestran en la Fig. 5b. El tiempo de vida medio de las moléculas de DAPI en las regiones de vida corta se determinó que era de 2,68 ± 0,08 ns, mientras que el de las moléculas en el resto de los cromosomas en la dispersión se determinó que era de 2,93 ± 0,08 ns.

FLIM de DAPI unido a cromosomas interfásicos dentro de núcleos fijos

También se obtuvo una imagen del tiempo de vida de DAPI unido a cromosomas interfásicos dentro de un núcleo fijado con metanol:ácido acético 3:1 de la línea celular de linfocitos GM18507, como se muestra en la Fig. 6. Se tomó una pila z del núcleo utilizando un microscopio confocal de excitación multifotónica (a 760 nm). Las Fig. 6a,c muestran imágenes obtenidas a -0,50 μm y +0,50 μm, respectivamente, desde el plano focal original (Fig. 6b).

Se observó un único carácter exponencial para el decaimiento de la fluorescencia DAPI. Las imágenes del tiempo de vida del núcleo medido muestran que hay una fuerte variación en el tiempo de vida de DAPI a través del núcleo interfásico, donde se pueden observar regiones localizadas de tiempos de vida cortos (indicadas por flechas en la Fig. 6). Aunque el núcleo fijado está algo colapsado en comparación con su forma esférica nativa como resultado del proceso de fijación, esto muestra las ubicaciones de las regiones de vida corta en tres dimensiones. La reconstrucción en 3D de las imágenes confocales z-stack (véase la Figura S4) y el análisis cuantitativo de las regiones de vida corta se llevaron a cabo utilizando el software Avizo.

La Tabla 4 muestra el volumen, la vida media y la posición con respecto al radio del núcleo de las regiones de vida corta. Los volúmenes calculados para las regiones de vida corta son mayores que el volumen típico de un cromosoma en metafase (~1-3 um3), lo que sugiere una considerable descomposición de la cromatina en interfase. Se calcularon las posiciones de las regiones de vida corta para determinar si tienen ubicaciones preferentes en el núcleo. Se puede observar en la tabla que las regiones de vida corta se localizan más cerca de la periferia que del centro del núcleo. Examinamos tres núcleos en este estudio y descubrimos que todos mostraban una distribución similar de regiones de vida corta (véanse las Figuras S6 y S7 para los otros dos núcleos).

También se midieron los cromosomas en interfase teñidos con DAPI dentro de un núcleo de células de fibroblastos de pulmón CCD37LU fijadas en metanol:ácido acético 3:1, como se muestra en la Fig. 7a. La imagen muestra la presencia de regiones de vida corta dentro del núcleo, similar a la observada en las células de linfocitos GM18507. Sin embargo, las regiones de vida corta no tienen una localización preferente dentro del núcleo. La figura 7b muestra la imagen FISH del núcleo medido. La sonda del centrómero del cromosoma 9 se muestra en rojo en la imagen. Comparando las Fig. 7a,b, se puede observar que la localización de la sonda del centrómero del cromosoma 9 se solapa con la de las dos regiones de vida corta. Otro núcleo medido muestra un resultado similar y se presenta en la Figura S8.