ChIP er en effektiv teknik, der bruges til at undersøge forbindelsen mellem specifikke proteiner eller deres modificerede isoformer og definerede genomiske regioner. Det er en hurtigt voksende forskningsteknik, der almindeligvis anvendes til at kortlægge DNA-protein-interaktioner i celler, som er afgørende for korrekt genregulering. De kan f.eks. bruges til at fastslå, om proteiner som transkriptionsfaktorer og modificerede histoner binder sig til et bestemt område af DNA i levende celler eller væv.
Den genomdækkende kortlægning af protein-DNA-interaktioner er afgørende for en fuldstændig forståelse af genregulering. En detaljeret kortlægning af epigenetiske mærker og transkriptionsfaktorbinding er nødvendig for at udlede de reguleringsnetværk, der understøtter genekspressionen i en række biologiske systemer. Det mest udbredte værktøj til undersøgelse af disse interaktioner er ChIP efterfulgt af massivt parallel sekventering (ChIP-seq)
Hvordan fungerer ChIP-seq?
ChIP-seq begynder med et traditionelt ChIP-assay, der omfatter cellefiksering (cross-linking), kromatinskæring, immunoprecipitation (IP), reverse-crosslinking og DNA-oprensning. Levende celler fikseres med et reversibelt krydsbindingsmiddel for at fastholde protein-DNA-interaktioner på deres naturlige steder, inden de lyseres for at frigøre kromatinet med henblik på klipning. Efter krydsbinding klippes kromatinet til et bestemt størrelsesområde (100-500 bp) for at opnå optimale IP og ChIP-seq-resultater. Der kan anvendes enten sonicering eller enzymatisk klipning for at opnå fragmentstørrelser mellem 100-500 bp, hvorefter kromatinet immunoprecipiteres ved hjælp af et antistof af interesse og isoleres.
ChIP vil producere et bibliotek af mål-DNA-steder, der var i direkte fysisk kontakt med reguleringsmekanismer in vivo. Oligonukleotidadaptere tilføjes derefter til de DNA-fragmenter, der var bundet til det pågældende protein, for at muliggøre massivt parallel sekventering. Efter størrelsesudvælgelse sekventeres alle de resulterende ChIP-DNA-fragmenter samtidigt, hvorved der scannes for genomdækkende associationer med høj opløsning. Ved at kortlægge de sekventerede fragmenter til databaser med sekvenser for hele genomet kan DNA-interaktionsmønstret for enhver TF eller epigenetisk modifikation analyseres hurtigt og effektivt.
ChIP-seq er blevet muliggjort af teknologiske fremskridt, som gør det muligt at kortlægge hele genomer og udpege de nøjagtige bindingssteder for proteiner ved at kombinere ChIP-assay med næste generations sekventeringsplatforme. Ved at udpege en specifik gensekvens, som et protein binder sig til ved hjælp af ChIP-seq, kan epigenetiske forskere fremme deres undersøgelser af protein-DNA-interaktion og opnå værdifuld indsigt i sygdomsudvikling.