ChIP è una potente tecnica usata per studiare l’associazione di specifiche proteine, o delle loro isoforme modificate, con regioni genomiche definite. È una tecnica di ricerca in rapida crescita ed è comunemente usata per mappare le interazioni DNA-proteine nelle cellule che sono cruciali per una corretta regolazione genica. Per esempio, possono essere usati per determinare se proteine come fattori di trascrizione e istoni modificati si legano a una particolare regione del DNA di cellule o tessuti viventi.
La mappatura a livello genomico delle interazioni proteina-DNA è essenziale per una comprensione completa della regolazione genica. Una mappa dettagliata dei segni epigenetici e del legame dei fattori di trascrizione è necessaria per dedurre le reti di regolazione che sono alla base dell’espressione genica in una varietà di sistemi biologici. Lo strumento più utilizzato per esaminare queste interazioni è il ChIP seguito dal sequenziamento parallelo massivo (ChIP-seq)
Come funziona il ChIP-seq?
Il ChIP-seq inizia con un test ChIP tradizionale che prevede la fissazione delle cellule (cross-linking), il taglio della cromatina, l’immunoprecipitazione (IP), il reverse-crosslinking e la purificazione del DNA. Le cellule viventi sono fissate con un agente reticolante reversibile per mantenere le interazioni proteina-DNA nei loro siti naturali prima di essere lisate per rilasciare la cromatina per il taglio. Dopo la reticolazione, la cromatina viene tosata ad un intervallo di dimensioni specifiche (100-500 bp) per un IP ottimale e ChIP-seq risultati. Sia la sonicazione che la tosatura enzimatica possono essere utilizzate per ottenere frammenti di dimensioni comprese tra 100-500 bp, la cromatina viene poi immunoprecipitata utilizzando un anticorpo di interesse e isolata.
ChIP produrrà una libreria di siti di DNA bersaglio che erano in contatto fisico diretto con meccanismi di regolazione in vivo. Gli adattatori oligonucleotidici sono poi aggiunti ai frammenti di DNA che sono stati legati alla proteina di interesse per consentire il sequenziamento massivo parallelo. Dopo la selezione delle dimensioni, tutti i frammenti di DNA ChIP risultanti vengono sequenziati simultaneamente, cercando associazioni a livello di genoma con alta risoluzione. La mappatura dei frammenti sequenziati su database di sequenze dell’intero genoma permette di analizzare rapidamente ed efficacemente il modello di interazione del DNA di qualsiasi TF o modifica epigenetica.
Il ChIP-seq è stato reso possibile dai progressi tecnologici che ci permettono di mappare interi genomi e di individuare con precisione i siti di legame delle proteine combinando il saggio ChIP con le piattaforme di sequenziamento di nuova generazione. Individuare una specifica sequenza genica a cui si lega una proteina utilizzando ChIP-seq aiuta i ricercatori epigenetici a far progredire i loro studi di interazione proteina-DNA e a ricavare preziose informazioni sullo sviluppo delle malattie.