The use of DAPI fluorescence lifetime imaging for investigating chromatin condensation in human chromosomes

Excited State Characteristics of Free DAPI and DAPI Bound to DNA

Doba života excitovaného stavu DAPI je dobře známá26, proto jsme měřili dobu života nenavázaného DAPI v roztoku PBS (pH 7.2), abychom určili citlivost systému i přesnost měření doby života. Rozpad fluorescence vykazoval dvojitý exponenciální charakter: složky doby života fluorescence, τ a koeficienty intenzity, a, jsou uvedeny v tabulce 1. Hodnota dlouhé složky doby života se dobře shoduje s literaturou, zatímco hodnota krátké složky doby života je vyšší než hodnota popsaná v literatuře při pH 7, kde je rozsah hodnot 0,19-0,24 ns26.

Dále jsme měřili doby života DAPI vázaného na DNA obsahující různé množství AT a GC bází, abychom zjistili, zda složení bází DNA má nějaký vliv na dobu života DAPI. Pro tuto část studie byly použity DNA telecího brzlíku (CT) a micrococcus luteus (ML) z důvodu jejich odlišného složení párů bází (42 % GC u CT DNA a 72 % GC u ML DNA). Byly měřeny vždy tři roztoky CT a ML DNA. Doby života DAPI pro každý typ DNA vykazovaly dvě složky (tabulka 1). Krátká složka doby života DAPI vázaného na ML DNA je o něco vyšší než u CT DNA (rozdíl 130 ps). Mezi dlouhými složkami doby života nebyl pozorován žádný významný rozdíl.

FLIM DAPI vázaného na fixované metafázní chromozomy z B-lymfocytů

Obrázek 1a ukazuje obraz doby života typického „rozprostření“ lidských metafázních chromozomů fixovaných v poměru 3:1 methanol:kyselina octová (definice rozprostření chromozomů viz Metody). Rozšířený obraz uzavřené oblasti na obrázku pořízený s vyšším rozlišením pixelů je uveden na obr. 1b. Pro znázornění hodnoty doby života v každém pixelu obrazu je použita falešná barva.

Oba obrázky ukazují, že podél délky chromozomů dochází k rozdílům v době života DAPI. Na obr. 1b jsou také uvedeny křivky rozpadu fluorescence DAPI s normalizovanými intenzitami, které doplňují snímky doby života a ukazují, že fluorescence molekul DAPI v červených oblastech má rychlejší rozpad než v modrých oblastech. Průměrná doba života ± směrodatná odchylka (SD) DAPI pro změřený rozptyl chromozomů na obr. 1a byla stanovena na 2,91 ± 0,12 ns; bylo zjištěno, že rozpad fluorescence DAPI má jednoduchou exponenciální charakteristiku.

Identifikace heteromorfních oblastí v chromozomech

Ze tří sklíček bylo změřeno dvanáct rozptylů chromozomů (buňky GM18507), každý se 46 chromozomy. Obrázek 2a ukazuje celoživotní snímek jednoho z měřených rozsevů. U každého z měřených rozptylů jsme zjistili, že některé chromozomy mají po celé své délce specifické oblasti, které mají výrazně kratší dobu života než zbytek chromozomu, většinou v těsné blízkosti centromer. Tyto oblasti se na snímcích doby života zobrazují červeně kvůli použité barevné škále; budeme je označovat jako oblasti s krátkou dobou života.

Křivky rozložení doby života s normalizovanými četnostmi pro oblasti s krátkou dobou života a zbytek chromozomů na obr. 2a jsou uvedeny na obr. 2b. Průměrná doba života ± SD molekul DAPI v oblastech s krátkou dobou života na obr. 2a byla stanovena na 2,48 ± 0,13 ns, zatímco pro molekuly ve zbytku chromozomů v rozptylu byla stanovena na 2,80 ± 0,09 ns. Směrodatné odchylky představují, jak rozdílné jsou hodnoty doby života v rámci oblastí s krátkou dobou života a zbytku chromozomů pro naměřené rozpětí.

Předpokládali jsme, že oblasti s krátkou dobou života odpovídají heteromorfním oblastem v chromozomech. Takové oblasti vykazují odchylky v morfologii na určitých místech, přičemž neovlivňují fenotyp, a často jsou heterochromatické povahy. Známé morfologické odchylky heteromorfních oblastí jsou spojeny s dlouhověkostí a neplodností, a proto jsou velmi zajímavé pro genetické studie. Je známo, že heteromorfní oblasti se vyskytují na chromozomech 1, 9, 15, 16 a chromozomu Y27.

Bylo rozhodnuto provést experimenty mFISH (viz Metody) na všech měřených rozsazích s cílem identifikovat chromozomy obsahující oblasti s krátkou životností. Obraz mFISH a karyotyp rozptylu na obr. 2a jsou zobrazeny na obr. 2c,d v tomto pořadí. Oblasti vykazující kratší dobu života ve srovnání se zbytkem chromozomů ve všech měřených rozptylech byly identifikovány jako pericentromerické oblasti chromozomů 1, 9 a 16, krátké raménko chromozomu 15 a distální oblast chromozomu Y; tyto oblasti jsou známé jako heteromorfní oblasti, což potvrzuje naši hypotézu.

Tabulka 2 ukazuje průměrnou hodnotu doby života DAPI pro každou z heteromorfních oblastí na obr. 2a. Vzhledem k tomu, že každý autosom se objeví dvakrát, byly průměrné hodnoty doby života a směrodatné odchylky pro heteromorfní oblasti získané pro autosomy se stejným číslem chromosomu zprůměrovány, resp. sloučeny.

Z tabulky lze vypozorovat, že naměřené doby života pro heteromorfní oblasti chromozomů 1, 16 a Y jsou podobné a jsou výrazně delší než u chromozomů 9 a 15. Heteromorfní oblast chromozomu 9 lze popsat dvěma dobami života, takže oblast 9a má podobnou hodnotu jako oblast chromozomu 15, zatímco oblast 9b má kratší dobu života než oblast 9a.

Ostatní naměřená rozpětí (viz tabulky S1-S11 v Doplňkových materiálech) ukazují podobný trend, že heteromorfní oblasti chromozomů 9 a 15 mají kratší dobu života než oblasti chromozomů 1, 16 a Y.

Trendy v životnosti DAPI v závislosti na ploše chromozomů

Je známo, že chromozomy se stávají postupně kompaktnějšími, jak se blíží k metafázové fázi buněčného cyklu; pro tuto studii byl použit Colcemid k zablokování buněk v této fázi před sběrem. Neočekává se však, že všechny buňky v synchronizované populaci budou při sklizni přesně ve stejné fázi kondenzace. Tato variabilita v kondenzaci se odráží v rozdílech v relativní ploše určitého chromozomu od jednoho rozprostřeného chromozomu k druhému na stejném sklíčku, přičemž kompaktnější chromozomy mají menší plochy. Předpokládali jsme, že různé stavy zhutnění mohou mít vliv na pozorované doby života fluorescence. Abychom změřili vliv kompakce chromatinu na doby života, korelovali jsme průměrné doby života DAPI pro různé příklady chromozomů 1 (buňky GM18507) z jednoho sklíčka a jejich heteromorfních oblastí s naměřenou plochou chromozomů. Jak bylo popsáno dříve, hodnoty dob života pro dvojice chromozomů byly zprůměrovány, pixelům byla přiřazena barva podle hodnoty doby života a oblasti s krátkou dobou života (červené oblasti) byly považovány za heteromorfní povahy. Segmentace a analýza heteromorfních oblastí a výpočet ploch chromozomů byly provedeny pomocí softwaru Avizo.

Kraf na obr. 3 ukazuje, že průměrné doby života DAPI pro chromozom 1 a jeho heteromorfní oblast silně klesají se zmenšující se plochou chromozomu 1. Do té míry, do jaké plocha chromozomu v rozptylu představuje hustotu balení, naznačuje pozorovaný trend lineární závislost na hustotě, která představuje stupeň kondenzace. Podobný trend je pozorován také u rozprostřených chromozomů na jiném sklíčku (viz obrázek S1).

Vliv koncentrace DAPI na dobu života

S cílem určit vliv koncentrace DAPI na dobu života byly změřeny průměrné doby života DAPI pro různé chromozomy 1 (buňky GM18507) obarvené různými koncentracemi DAPI. Pro každou koncentraci bylo změřeno dvanáct chromozomů 1 o přibližně stejné ploše ze stejného sklíčka.

Z tabulky 3 je patrné, že celková intenzita chromozomu 1 se zvyšovala se zvyšující se koncentrací DAPI. Nebyly však pozorovány žádné významné rozdíly v době života DAPI mezi různými koncentracemi.

FLIM Hoechstu 33258 vázaného na fixované metafázní chromozomy

Abychom potvrdili, že námi pozorované změny doby života podél chromozomů jsou funkcí struktury chromatinu a nejsou způsobeny žádnými vlivy specifickými pro DAPI, provedli jsme FLIM s použitím jiného barviva vázaného na minoritní rýhy. Metafázní chromozomy (buňky GM18507) fixované v poměru 3:1 methanol:kyselina octová byly obarveny Hoechstem 33258.

Obrázek 4 ukazuje obraz životnosti měřeného rozprostření chromozomů. Bylo zjištěno, že rozpad fluorescence Hoechstu 33258 navázaného na chromozomy má jednoduché exponenciální charakteristiky, podobně jako u DAPI. Průměrná doba života ± SD Hoechstu 33258 pro změřený rozptyl byla stanovena na 2,42 ± 0,05 ns. Menší směrodatná odchylka ve srovnání s odchylkou chromozomů obarvených DAPI (0,12 ns) ukazuje, že variabilita doby života Hoechst 33258 v celém rozptylu není tak vysoká jako u chromozomů obarvených DAPI. Obraz doby života ukazuje, že heteromorfní oblasti chromozomů 1, 9, 15, 16 a Y vykazovaly výrazně kratší hodnoty doby života než zbytek chromozomů (viz obrázek S2 pro obraz mFISH a karyotyp), podobně jako u chromozomů barvených DAPI. Průměrná doba života ± SD molekul Hoechst 33258 v heteromorfních oblastech byla stanovena na 2,36 ± 0,03 ns, zatímco pro molekuly ve zbytku chromozomů v rozptylu byla stanovena na 2,43 ± 0,04 ns. Průměrné hodnoty doby života Hoechst 33258 a směrodatné odchylky pro jednotlivé heteromorfní oblasti chromozomů 1, 9, 15, 16 a Y ve srovnání se zbytkem chromozomu jsou uvedeny v tabulce S12.

Tento dodatečný experiment s použitím Hoechstu potvrzuje, že rozdíly v době života pozorované podél chromozomů jsou způsobeny místní strukturou chromatinu, a nikoli použitým fluoroforem.

FLIM DAPI vázaného na fixované metafázní chromozomy z buněk HeLa

MěřeníFLIM na metafázních chromozomech barvených DAPI získaných z buněk HeLa fixovaných v poměru 3:1 methanol:kyselina octová bylo rovněž provedeno s cílem ověřit, že odchylky v době života DAPI pozorované podél délky chromozomů nejsou specifické pouze pro buněčnou linii, ale jsou způsobeny obecnou strukturou chromatinu.

Obrázek 5a ukazuje naměřené rozložení chromozomů. Průměrná doba života ± SD DAPI pro naměřené rozprostření byla stanovena na 2,93 ± 0,09 ns. Kratší doby života DAPI ve srovnání se zbytkem chromozomů jsou pozorovány v heteromorfních oblastech chromozomů 1, 9, 15, 16 a Y (viz obrázek S3 pro snímek mFISH a karyotyp), podobně jako u buněk GM18507. Čtyři abnormální chromozomy sestávající z části chromozomu 1 nebo 9 rovněž vykazovaly kratší dobu života DAPI ve svých pericentromerických oblastech, což naznačuje, že obsahují heteromorfní oblast chromozomu 1 nebo 9. DAPI se v těchto oblastech vyskytuje pouze jednou. Křivky distribuce doby života s normalizovanými četnostmi pro oblasti s krátkou dobou života a zbytek chromozomů jsou uvedeny na obr. 5b. Průměrná doba života molekul DAPI v oblastech s krátkou dobou života byla stanovena na 2,68 ± 0,08 ns, zatímco pro molekuly ve zbytku chromozomů v rozptylu byla stanovena na 2,93 ± 0,08 ns.

FLIM DAPI vázaného na interfázní chromozomy v rámci fixovaných jader

Doba života DAPI vázaného na interfázní chromozomy v rámci jádra fixovaného v poměru 3:1 methanol:kyselina octová z buněčné linie lymfocytů GM18507 byla rovněž zobrazena, jak je uvedeno na obr. 6. Z-stack jádra byl pořízen pomocí konfokálního mikroskopu s multifotonovou excitací (při 760 nm). Obr. 6a,c ukazují snímky získané ve vzdálenosti -0,50 μm, resp. +0,50 μm od původní ohniskové roviny (obr. 6b).

Pro rozpad fluorescence DAPI byl pozorován jediný exponenciální charakter. Obrázky životnosti měřeného jádra ukazují, že existuje silná variace v životnosti DAPI napříč interfázním jádrem, kde lze pozorovat lokalizované oblasti s krátkou dobou života (označené šipkami na obr. 6). I když je fixované jádro v důsledku procesu fixace poněkud zhroucené oproti svému přirozenému kulovitému tvaru, ukazuje to umístění oblastí s krátkou dobou života ve třech rozměrech. Pomocí softwaru Avizo byla provedena 3D rekonstrukce konfokálních z-stack snímků (viz obr. S4) a kvantitativní analýza oblastí s krátkou dobou života.

Tabulka 4 ukazuje objem, střední dobu života a polohu vzhledem k poloměru jádra oblastí s krátkou dobou života. Bylo zjištěno, že vypočtené objemy oblastí s krátkou dobou života jsou větší než typický objem chromozomu v metafázi (~1-3 um3), což naznačuje značnou dekompozici chromatinu v interfázi. Poloha oblastí s krátkou dobou života byla vypočtena s cílem určit, zda mají preferenční umístění v jádře. Z tabulky je patrné, že oblasti s krátkou dobou života se nacházejí blíže k periferii než ke středu jádra. V této studii jsme zkoumali tři jádra a zjistili jsme, že všechna vykazují podobné rozložení oblastí s krátkou dobou života (viz obrázky S6 a S7 pro další dvě jádra).

V jádře z buněk plicních fibroblastů CCD37LU fixovaných v poměru 3:1 methanol:kyselina octová byly také měřeny interfázní chromozomy obarvené DAPI, jak ukazuje obr. 7a. Obrázek ukazuje přítomnost oblastí s krátkou dobou života v jádře, podobně jako tomu bylo u buněk lymfocytů GM18507. Oblasti s krátkou dobou života však nemají v jádře žádné přednostní umístění. Obrázek 7b ukazuje obraz FISH měřeného jádra. Centromerová sonda chromozomu 9 je na obrázku znázorněna červeně. Při porovnání obrázků 7a,b lze pozorovat, že umístění centromerové sondy chromozomu 9 se překrývá s umístěním dvou oblastí s krátkou dobou života. Další změřené jádro vykazuje podobný výsledek a je uvedeno na obrázku S8.

.