Vad är immunohistokemisk (IHC) färgning?

Immunfärgning använder antikroppar för att upptäcka ett antigen i celler eller vävnad. Den stora fördelen med immunfärgning i immunohistokemi (IHC) är möjligheten att se det önskade målet i ett vävnadsprov samtidigt som det rumsliga sammanhanget och vävnadsarkitekturen bibehålls.

Immunohistokemi (IHC) färgning: Kort definition

Typer av färgning

Immunostaining kan utföras antingen direkt eller indirekt. Konjugering av våra applikationsvaliderade antikroppar till ett antal fluorophorer möjliggör direkt märkning. Klicka här för att se vårt utbud av direkta konjugat.

Ofta är ett direktkonjugat, baserat på antigenuttrycksnivåer och tillgänglighet, inte tillräckligt för att visualisera det aktuella målet. I dessa fall används indirekt märkning med hjälp av en sekundär antikropp. Den föredragna metoden vid CST är att använda högkänsliga, polymerbaserade detektionsreagenser i ett steg som är specifika för kanin- eller mus-IgG.

Exempel på IHC-färgning

Nedan följer några exempel på IHC-färgning som utförts vid CST. Var och en av de antikroppar som används nedan har genomgått vår rigorösa valideringsprocess för att med säkerhet kunna bedöma specifik detektion av det önskade antigenet.

Hur görs immunohistokemisk (IHC) färgning?

Vävnadsförberedelse

Vävnadsinsamling, konservering och fixering varierar beroende på provet eller målet av intresse. Insamling och fixering av vävnaden påverkar direkt provets integritet och dina experimentella resultat.

Tvärbindande fixeringsmedel, som formalin, används ofta för att förbereda prover för IHC eftersom de bevarar vävnadens strukturella integritet, vilket bidrar till att upprätthålla vävnadsarkitekturen. Ett annat alternativ är att kryokonservera (frysa) dina prover, vilket kan vara ett bättre alternativ om du försöker upptäcka ett fosforylerat mål.

Antigen (Epitope) Retrieval

Fixeringsmedel som används för att bevara vävnadsprovets strukturella integritet har också nackdelar i den bemärkelsen att de kan begrava den epitop som din antikropp är utformad för att känna igen.

Det finns flera metoder för att avslöja epitoper som har maskerats av fixeringen. Dessa inkluderar proteolytiskt inducerad antigenåtervinning, som förlitar sig på ett enzym som proteinas K, eller värmeinducerad epitope retrieval (HIER), som använder värme för att bryta upp tvärbundna bindningar och avveckla proteiner. Båda metoderna kan avmaska epitoper, vilket gör dem tillgängliga för den primära antikroppen och gör dem mottagliga för färgning med IHC.

Vid CST är vår vanligaste antigenhämtningsmetod HIER. Våra forskare testar dock flera olika metoder för antigenåtervinning för att fastställa de optimala förhållandena för användning av varje antikropp i IHC. Det rekommenderade protokollet från CST finns på databladet för varje IHC-validerad antikropp.

Antikroppsbindning

Välja rätt antikropp är ett av de mest kritiska stegen för att få ett lyckat IHC-resultat. Alla IHC-validerade antikroppar från CST verifieras inte bara för att de har en stark signal i vävnad utan genomgår också ett strängt valideringsförfarande för att bekräfta signalens specificitet. Våra forskare, som är specialiserade på IHC, testar ett stort antal antikroppar och rekommenderar endast de som är bäst lämpade för applikationen.

Klicka här för att bläddra bland IHC-validerade antikroppar för ditt mål.

Detekteringssystem

Immunohistokemisk (IHC) färgning möjliggör 2 breda klasser av detektion: 1) kromogena och 2) fluorescerande. För kromogen detektion rekommenderar CST att man använder polymerbaserade system som undviker begränsningarna hos det biotinbaserade systemet och samtidigt ökar känsligheten hos analysen.

Try SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, kanin) #8114 eller SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, mus) #8125 beroende på värddjursspecies för din primära antikropp.

Konterfärgning

Efter antikroppsdetektering föredrar många forskare att kontrafärga vävnaden för att visualisera den cellulära anatomin och orientera betraktaren med avseende på den specifika färgningen. Vid CST använder vi motfärgning av våra prover med Hematoxylin #14166, som färgar kärnan blått. När du väljer en motfärgning är det viktigt att motfärgningen är kompatibel med ditt kromogen. Om t.ex. färgen på motfärgen är för lik kromogenfärgen kommer antikroppssignalen att vara svår att känna igen.

Immunohistokemi (IHC) Färgningsprotokoll

Nedan följer en översikt över vårt rekommenderade protokoll och framhävda är de viktigaste stegen för ett lyckat experiment. CST vill hjälpa dig att förbättra din IHC-analys genom att tillhandahålla validerade antikroppar och reagenser så att du kan följa ett enkelt, produktspecifikt protokoll och uppnå reproducerbara resultat med minimal optimering som krävs.

Klipp på videon om IHC-protokollet eller besök vår sida för val av protokoll.