Vätskekromatografi-Masspektrometri i livsmedelsanalys

Bestämningen av organiska spårämnen i livsmedelsanalys är av stor betydelse för livsmedelskvalitet och livsmedelssäkerhet. Både separationen av analyten från potentiella inferenser i matrisen och den kvalitativa och kvantitativa bestämningen av målföreningen är viktiga steg i analytisk livsmedelskemi.

Definition

Vätskekromatografi (LC, här högpresterande LC – HPLC) är en fysikalisk separationsteknik för spåranalys. Den bygger på interaktion mellan en analyt och en stationär fas (kolonn med partiklar) och en mobil fas (flytande eluent eller en blandning av eluenter). Masspektrometri (MS) är ett analysverktyg för att mäta ett provs sammansättning. MS genererar användbar information om analyters molekylvikt och struktur och hjälper till att klarlägga okända föreningar.

Kombinationen, LC/MS, LC-MS är en kraftfull teknik på grund av dess mycket höga känslighet (upp till ppt-området) och specificitet. När det gäller analys av organiska spår används MS för många tillämpningar, men till skillnad från GC/MS (gaskromatografi, kopplat till masspektrometri) är den avsedd för analys av prover som innehåller icke-flyktiga analytiska mål, vanligen med en massa mellan 200 och 800u, som är termiskt labila, uppvisar hög polaritet eller har en hög molekylmassa.

Arbetsprincipen

I princip måste en LC/MS-enhet utföra de fyra arbetsstegen, inklusive:

1. Kromatografisk separation av analyterna genom en separationskolonn
2. Ionisering av analyten
3. Isolering av jonerna och
4. Identifiering av jonerna

Inte generellt sett är det inte trivialt att koppla ihop ett HPLC-system med en masspektrometer, eftersom svårigheten ligger i att omvandla en löst ämne till en jon i gasfas. Utmaningen är att göra sig av med lösningsmedlet samtidigt som man upprätthåller en tillräcklig vakuumnivå i masspektrometern och att generera gasfasjonerna. Därför förs komponenter som eluerar från den kromatografiska kolonnen in i masspektrometern via ett specialiserat gränssnitt.

De två mest använda joniseringsgränssnittssystemen, kemisk jonisering vid atmosfärstryck (APCI) och elektrosprayjonisering (ESI), väljs beroende på analyternas fysikalisk-kemiska egenskaper (t.ex. polaritet och surhet). Joniseringen sker vid atmosfärstryck och båda anses vara en mjuk joniseringsmetod, dvs. masspektrumet ger huvudsakligen information om molekylvikten, såvida inte fragmenteringstekniker används.

Då föreningar delvis sameluteras från det kromatografiska systemet, kan en tydlig tilldelning av de enskilda fragmenten inte åstadkommas med hjälp av enbart LC-MS, där endast molekylärjonmassor är tillgängliga. För att lösa detta problem används numera huvudsakligen tandem-masspektrometri (MS/MS), som omfattar flera steg av massval eller analys (LC/MS/MS/MS eller LC/MSn). Dessa system kan bestämma rester i det lägre ppt-området. För att kvalificera organiska molekyler krävs en annan teknisk MS-uppställning. Ett möjligt tillvägagångssätt för kvalificering är att använda en MS som genererar joner, leder dem till en linjär jonfälla och sedan lagrar dem i ett radiofrekvent fält. Därefter möjliggör olika tekniska möjligheter att kvalificera jonerna och därmed den okända föreningen.

Användningar

Sedan LC/MS introducerades i rutinanalyser för cirka tio år sedan har den etablerats inom de flesta områden av analytisk kemi, t.ex. kvalitetskontroll, grundläggande och tillämpad forskning och statlig kontroll.

Följande exempel ger en kort översikt:

a) Farmaci

• Farmakokinetiska studier av läkemedel, t.ex. nedbrytningsprocesser för läkemedel
• Läkemedelsutveckling, t.ex. Identifiering av metaboliter eller föroreningar

b) Molekylärbiologi

• Proteomik, t.ex. storskaliga studier av proteiner, särskilt deras strukturer och funktioner
• Metabolomik, t.ex.t.ex. bestämning av metaboliska intermediärer, hormoner och andra signalmolekyler

c) Miljö

• Avloppsvatten, t.ex. endokrina föreningar
• Bjord, t.ex. metallorganiska ämnen

d) Livsmedel

• Ingredienser, t.ex. aminosyror, lipider
• Föroreningar, t.ex. Analys av flera restsubstanser av bekämpningsmedel, toxiner från fisk och skaldjur, veterinärrester, bestämning av färgämnen, akrylamid, analys av mikrocystiner
• Naturprodukter, t.ex. terpener, steroider

Perfluorerade tensider (PFC) som ett exempel på livsmedelsanalys

Bakgrund

PFC är ett utmärkt exempel på hur man kan kombinera komplexa provberedningar med sofistikerade LC/MS-apparater och djupgående kunskaper i analytisk kemi. De unika egenskaperna hos PFT gör dem användbara i en rad industriella och kommersiella produkter, t.ex. kylvätskor, polymerer och som komponenter i läkemedel och bekämpningsmedel. Särskilt perfluorerade karboxylater (t.ex. PFOA – perfluoroktansyra) och perfluorerade sulfonater (t.ex. PFOS – perfluoroktansulfonsyra) används som ytaktiva ämnen, t.ex. för att impregnera textilier och mattor, i brandsläckningsskum och för fettskyddande behandlingar inom pappersindustrin. PFC har tillverkats i över 50 år och distribueras nu över hela världen. Om C-H-bindningar inte helt ersätts med C-F-bindningar, en av de starkaste kemiska bindningar man känner till, är nedbrytning fortfarande möjlig.

Endast PFOA och PFOS är toxikologiskt utvärderade (kroniskt giftiga och cancerframkallande), alla andra homologa föreningar, isomerer etc. är ännu inte utvärderade. Ur fysisk synvinkel är PFC både persistenta (dvs. icke nedbrytbara) och rörliga (dvs. kan läcka ut från förorenade jordar till grundvattnet). Detta utgör ett permanent hot i samband med dricksvattenuttag och/eller konditionering av dricksvatten. Dessutom förs dessa föreningar in i näringskedjan genom växtöverföring.

Det faktum att man 2006 upptäckte höga halter av PFC-föroreningar i två tyska floder väckte allmänhetens intresse för dessa föreningar.

Föroreningarna från 2006 kan ha sitt ursprung i organiskt slam, som användes som gödningsmedel för jordbruksändamål. Det visade sig att jorden innehåller upp till 600 µg PFC/kg, vilket orsakade förorening av dricksvatten och försörjningsanläggningar. Hittills har sju tyska delstater rapporterat PFC-föroreningar.

Fraunhofer IME

En av kärnkompetenserna hos Fraunhoferinstitutet för molekylärbiologi och tillämpad ekologi är utvecklingen av genomförbara och tillförlitliga metoder för identifiering och analys av kemiska föroreningar i livsmedel och miljömatriser.

Sedan 1999 har Fraunhofer IME genomfört projekt för att mäta PFC-föroreningar i olika miljömatriser. Detta arbete har utförts på uppdrag av industriella partner och har särskilt inriktats på PFC-karboxylater och PFC-sulfonater. Ytterligare undersökningar genomfördes på uppdrag av övervakningsprogrammet för den tyska federala miljöprovbanken, som även omfattade blodprover från människor. Under 2005 genomfördes de första undersökningarna på området för livsmedelsprodukter, och under 2006 diskuterades även resultaten från utvalda livsmedelsprover (t.ex. bröstmjölk och pommes frites) i medierna. Större projekt med fokus på växtöverföring, potatis och produkter, mänskliga matriser (blod och bröstmjölk) samt miljöprover (t.ex. avloppsvatten, slam och jord) genomfördes 2007.

Analytisk lösning

Tre olika provpreparationer tillämpades för att täcka in alla tänkbara provmatriser:

• IPE (Ion pair extraction). Användning av jonparningsmedlet tetra-n-butylammoniumhydrogensulfat följt av en vätskefast extraktion (t.ex. miljöprover)
• AAE (acid alkaline extraction). Avlägsnande av lipiderna med hexan vid pH 14 (flytande ammoniaklösning), justering till pH 1 med saltsyra och extraktion med tert-butylmetyleter (t.ex. bröstmjölk)
• SPE (fastfasextraktion, för närvarande den mest citerade metoden) med patroner av olika polaritet beroende på PFC:s jonkaraktär i ett buffrat medium (t.ex.potatis)

Användning av interna standarder för kalibrering rekommenderas starkt; för närvarande omfattar våra metoder nio massemärkta PFC-standarder. Innan proverna förs in i LC/MS måste själva apparaten kontrolleras för teflonbelagda reservdelar, eftersom de innehåller avgivande PFC som kommer att påverka resultaten på ett icke-reproducerbart sätt. Dessa delar måste bytas ut, vilket kräver en överlägsen kunskap om LC/MS-komponenterna.

Analytiskt exempel

För analyserna av rå potatis och potatisprodukter anpassade vi vår LC/MS/MS (HPLC Alliance 2695 med Quattro Ultima Pt i Electrospray negative mode, båda Waters; 150 x 2 mm Luna 3 µm C18(2)-kolonn, Phenomenex) för målmassor av 9 perfluorkarboxylsyror (C4-C12) och 3 perfluorsulfonsyror (C4, C6, C8) med hjälp av 13C-märkta referensmaterial (LOQ 0.5 µg/Kg) efter en SPE-provberedning.

PFC:erna var olika fördelade i rå potatis och i potatisprodukter (tabell 1), vilket gör det möjligt att anta en kontaminering under bearbetningen samt en kontaminering av marken. Detta kan stödjas av våra PFC-undersökningar av pommes frites från 2006, där vi analyserade pommes frites från snabbmatsrestauranger och hittade upp till 2,8 µg PFOA/kg och upp till 0,9 µg PFOS/kg.

Analysutsikter

Fraunhofer IME har betydande sakkunskap och erfarenhet av PFC-analyser, vilket skulle kunna tillämpas på många områden av PFC-kontaminering i miljön/livsmedel som ännu inte har undersökts. Viktiga områden för framtida PFC-forskning kan vara att öka antalet analyter, många kort- och långkedjiga PFC ingår redan i vårt studieprogram, men vår analysförmåga skulle kunna uppgraderas genom att inkludera ytterligare PFC. De ytterligare PFC måste identifieras med LC/MS eftersom det inte finns några kommersiella standarder att tillgå. Detta kommer att leda till konsoliderade resultat när det gäller prekursorer, vägar för kontaminering av livsmedel och nedbrytning under bearbetning av livsmedel.