Resultat och diskussion
Två sätt att klyva DNA med R.KpnI i närvaro av Mg2+.
R.KpnI är ett mycket promiskuöst REas i Mg2+-katalyserade reaktioner, till skillnad från de flesta andra REaser (11, 12). I figur 1 A visas det karakteristiska klyvningsmönstret för R.KpnI i ett intervall av Mg2+-koncentrationer. Vid lägre koncentrationer av metalljonen (50-500 μM) observerades endast klyvning av den kognitiva sekvensen (körfält 2-5). Vid koncentrationer av Mg2+ >500 μM var dock promiskuös klyvning tydlig (körfält 6-9). De specifika och promiskuösa sätten att klyva R.KpnI beroende på Mg2+-koncentrationen bekräftades genom analys av klyvningen av oligonukleotider. Oligonukleotidsubstratet som innehåller den kanoniska sekvensen klyvs effektivt av R.KpnI även vid 20 μM Mg2+. Däremot klyvs icke-kanoniska sekvenser effektivt endast vid >500 μM Mg2+ . Dessa resultat innebar att R.KpnI uppvisar två olika metallaktiveringsprofiler – en för kanoniska och en för icke-kanoniska DNA-substrat. Enzymet följer en hyperbolisk metallaktiveringsprofil för det kanoniska substratet och ett sigmoidalt mönster för det icke-kanoniska substratet (fig. 1 B). Dessa data utsattes för Hill plot-analys (Fig. S2; och se SI Text ), och Hill-koefficienten för metalljonbindningen presenteras i tabell 1. Hill plot-analysen avslöjade bindningen av ytterligare metalljoner till enzymet och dess roll i klyvningen av icke-kanoniska sekvenser. Rekrytering av ytterligare en metalljon nära eller långt från enzymets aktiva plats tycktes alltså vara nödvändig för att inducera promiskuös klyvning av enzymet. Om så är fallet bör mutation av de rester som är involverade i metalljonkoordinationen på den andra platsen avskaffa den promiskuösa aktiviteten, vilket resulterar i ett mycket sekvensspecifikt enzym. Vi testade denna hypotes.