Abstract
För första gången rapporterades förekomsten av stamceller i mänsklig fostervatten för nästan tio år sedan. Sedan denna upptäckt har kunskapen om dessa celler ökat dramatiskt. I dag är fostervattenstamceller (AFS-celler) allmänt accepterade som ett nytt kraftfullt verktyg för grundforskning såväl som för att etablera nya stamcellsbaserade terapikoncept. Det är möjligt att generera monoklonala genomiskt stabila AFS-cellinjer med hög proliferationspotential utan att det uppstår etiska problem. Många olika grupper har visat att AFS-celler kan differentieras till alla tre könsskikten, vilket är av betydelse både för den vetenskapliga och terapeutiska användningen av dessa celler. Av särskild betydelse för det senare är det faktum att AFS-celler är mindre tumörigena än andra pluripotenta stamcellstyper. I den här artikeln har vi sammanfattat den nuvarande kunskapen om detta relativt unga vetenskapliga område. Dessutom diskuterar vi de relevanta framtidsperspektiven för detta lovande område inom stamcellsforskningen med fokus på de nästa viktiga frågorna som måste besvaras.
1. Introduktion
Trots att mänskliga fostervattenceller används i stor utsträckning vid rutinmässig prenatal diagnostik är kunskapen om dessa celler fortfarande begränsad. Föreställningen att odifferentierade och differentierade celler av varierande ursprung och linjer finns i fostervatten har dock fått stöd av flera rapporter under de senaste tre decennierna. Detta är inte förvånande med tanke på att man i fostervatten har påvisat celler som tillhör fosterhinnan, fosterhinnan och fostrets urogenitala, respiratoriska och gastrointestinala system. Under långvarig dräktighet kan fostrets andnings-, urin- och tarmsekret påträffas i fostervattnet. Dessutom är det också känt att sammansättningen, morfologin och tillväxtegenskaperna hos cellprover från fostervatten påverkas av vissa fosterpatologier, t.ex. neuralrörsdefekter eller gastroschisis .
Nytt intresse för celler som härrör från fostervatten initierades av två oberoende upptäckter. År 2001 föreslogs det att fostervattenceller skulle kunna användas i vävnadstekniska metoder för kirurgisk reparation av medfödda anomalier under den perinatala perioden. Författarna isolerade mekaniskt en subpopulation av celler från fostervatten från dräktiga tackor med en distinkt morfologi. Den immunocytokemiska profilen hos dessa celler var mycket jämförbar med den hos celler av mesenkymal, fibroblast/myofibroblast-linjeage. Dessa celler som härrör från fostervätska, som uppvisar en betydligt snabbare proliferation än jämförbara celler från foster och vuxna, kunde odlas på polymerställningar av polyglykolsyra upp till konfluenta cellskikt. Det har ursprungligen diskuterats att en sådan konstruerad konstruktion skulle vara optimal för att fungera som ett transplantat för implantation antingen under neonatalperioden eller till och med före födseln. Detta skulle kunna vara av särskilt intresse för barn som föds med en kroppsväggsdefekt och som är för unga för att man skall kunna ta ett transplantat från en annan del av kroppen för rekonstruktiv kirurgi. De resultat som uppnåtts i djurmodeller är verkligen uppmuntrande. Såvitt vi vet finns det dock hittills ingen rapport som beskriver den kliniska användningen av en sådan cellbaserad behandlingsmetod hos människor.
Ett annat fynd om fostervattenceller inledde ett mycket lovande och snabbt växande forskningsområde. För nästan tio år sedan publicerades det första förslaget om mänsklig fostervatten som en ny förmodad källa för stamceller . Det första beviset för förekomsten av AFS-celler visades genom upptäckten av en starkt proliferativ celltyp i mänsklig fostervätska som uttrycker den pluripotenta stamcellsmarkören Oct4. Förutom att dessa celler uttrycker markörer som är kända för att vara specifika för pluripotenta stamceller, har det visat sig att de uttrycker cellcykelproteiner som är kända för att vara specifika för cyklande celler . Efter denna första beskrivning har många grupper bekräftat existensen av dessa Oct4+/c-Kit+ AFS-celler och rapporterat om deras potential att differentiera till hematopoietiska, neurogena, osteogena, kondrogena, adipogena, renala, hepatiska och olika andra linjer . Även om AFS-cellerna när det gäller deras biologiska egenskaper och marköruttrycksmönster tycks vara mer lika embryonala stamceller (ES-celler) än t.ex. trophoblastceller, är AFS-cellernas exakta ursprung fortfarande svårdefinierat. Biokemiska, immunocytokemiska, biologiska och morfologiska undersökningar visade att AFS-celler utgör en ny och specifik enhet som skiljer sig från ES-celler eller andra stamcellstyper, t.ex. de som kan isoleras från amniotiska epitelceller eller trophoblastiska källor. I dag är det av stort intresse att klargöra två relevanta frågor när det gäller AFS-celler. Varifrån kommer de? Har de en biologisk funktion in vivo? Vi har redan tidigare diskuterat att AFS-celler förmodligen skulle kunna spela en roll i intrauterina sårläkningsprocesser. Hittills finns det dock inget experimentellt stöd för denna hypotes. Det är uppenbart att det för närvarande inte är så lätt att föreställa sig eller praktiskt genomförbart (eller att det ännu inte har utvecklats) att experimentella inställningar som gör det möjligt att bevisa denna hypotes.
Sedan deras första upptäckt har det varit av största vikt att klargöra frågan om AFS-celler verkligen har pluripotent differentieringspotential genom att framgångsrikt initiera differentiering till olika linjer med utgångspunkt i en enda stamcell. Det är relevant att notera att många olika rapporter i litteraturen som påstår sig beskriva forskning om AFS-celler inte ens har klargjort vilken typ av celler de arbetar med. Ofta använde forskarna bara en blandning av celler från fostervatten som erhållits genom särskilda odlingsförfaranden. Som nämnts ovan innehåller dock sådana cellblandningar från fostervatten en mängd olika specifika odifferentierade och differentierade celltyper. När en studie rapporterar en differentieringspotential för specifika cellinjer är det av högsta relevans att först klargöra vilken startcellstyp som användes (genom detaljerad biologisk och immunocytokemisk karakterisering). Dessutom kan beviset för att AFS-celler verkligen har en pluripotent differentieringspotential endast erhållas genom att utgå från en enda cell som karakteriseras som en stamcell. I alla andra fall skulle man kunna anta att en blandning av fostervattenceller, som har använts som utgångsmaterial, med stor sannolikhet innehöll en celltyp med potential att differentiera sig till ett specifikt släkte och andra celltyper med andra differentieringspotentialer. Eller så har det in vitro-differentieringsprotokoll som använts i vissa studier lett till ett urval (via en tillväxtfördel) för en redan (inkluderad) differentierad celltyp i stället för en bona fide-differentiering. Enstaka cellmetoder är obligatoriska och praktiska efter experiment med minimal utspädning.
Den första forskargruppen, som verkligen tog hänsyn till detta, rapporterade att det var möjligt att från en enda Oct4-positiv AFS-cell inducera adipogen, osteogen och neurogen differentiering . Författarna använde ett odlingsprotokoll i två steg följt av en detaljerad immunocytokemisk karakterisering av den erhållna stamcellstypen . Tre år senare isolerade en annan forskargrupp monoklonala AFS-celler genom flödescytometrisk selektion och minimal utspädning, som uttryckte stamcellsmarkörerna c-Kit och Oct4 . Författarna beskrev den första etableringen av monoklonala AFS-cellinjer med hög proliferationspotential som kunde odlas under många cykelperioder med en stabil kromosomstatus. Genom att använda sådana AFS-cellinjer kunde de visa att adipogen, osteogen, myogen, endotelial, neurogen och hepatisk celldifferentiering kunde induceras. Viktigt är att dessa författare också rapporterade att AFS-celler, till skillnad från ES-celler, inte inducerar tumörbildning hos SCID-möss (severe combined immunodeficient (SCID)) (för en detaljerad diskussion av denna aspekt se nedan) .
ES-celler kan, när de odlas i avsaknad av differentieringsfaktorer, spontant bilda tredimensionella flercelliga aggregat som kallas embryoida kroppar. Tidigare har embryokroppar allmänt betraktats som en optimal utgångspunkt för differentiering av stamceller till olika linjer. Följaktligen anses bildandet av embryokroppar följt av olika differentieringsinducerande metoder vara ett lämpligt sätt att bevisa den pluripotenta differentieringspotentialen hos en specifik stamcellstyp . Följaktligen var det av intresse att testa om AFS-celler, med utgångspunkt från en enda cell, kan bilda embryokroppar. Monoklonala humana AFS-celler kan faktiskt bilda embryokroppar när de odlas utan antidifferentieringsfaktorer under förhållanden där de inte kan fästa vid odlingsskålarnas yta och utan kontakt med matarceller. Bildandet av sådana tredimensionella flercelliga aggregat åtföljs av en minskning av uttrycket av stamcellsmarkörer och av en induktion av differentiering till olika linjer . Denna studie som visar att AFS-celler kan bilda embryokroppar var det slutgiltiga beviset för att AFS-cellerna är pluripotenta. Dessutom gör den det nu möjligt att återskapa och undersöka tredimensionella strukturer och sammanhang på vävnadsnivå för många differentieringsfenomen under tidig däggdjursembryogenes. Dessa resultat om AFS-cellernas pluripotens har erhållits med hjälp av monoklonala cellinjer som genererats genom magnetisk cellsortering och minimala utspädningsmetoder från mänskliga fostervattenprov. I dag finns det många olika etablerade monoklonala linjer som kan expanderas som omogna stamceller med hög proliferationshastighet i kultur utan behov av matarceller .
Tillsammans är det nuvarande kunskapsläget att AFS-celler har potential att differentiera till celltyper i de tre könsskikten (ektoderm, mesoderm och endoderm) och att de kan bilda embryokroppar, som är känt som det viktigaste steget i differentieringen av pluripotenta stamceller. Jämfört med andra typer av stamceller, t.ex. vuxna stamceller, ES-celler eller inducerade pluripotenta stamceller (iPS-celler), har AFS-celler specifika fördelar. Vuxna stamceller är ofta svåra att ta prov på, har lägre differentieringspotential än AFS-celler och kan inte odlas med hög proliferativ aktivitet. Att generera ES-cellinjer genom att förstöra ett mänskligt embryo ger upphov till en rad etiska frågor som diskuteras olika från land till land. Dessutom är ES-celler tumörbildande, medan AFS-celler, som redan nämnts ovan, inte inducerar tumörbildning hos svårt kombinerade immunbristande möss. Jämfört med iPS-celler finns det inget behov av ektopisk induktion av pluripotens i AFS-celler. AFS-celler är genomiskt stabila och har varken epigenetiskt minne eller somatiska mutationer från redan differentierade ursprungsceller. Dessutom har iPS-celler rapporterats ackumulera karyotypiska avvikelser och genmutationer under förökning i kultur. Nyligen har det rapporterats att iPS-celler under ektopisk induktion av pluripotens endast ofullständigt återskapar sitt epigenetiska mönster. Detta viktiga resultat måste beaktas när man planerar att använda dessa celler för detaljerade undersökningar av differentieringsprocesser och när man överväger att använda dem för nya möjliga terapeutiska metoder. AFS-celler uppvisar redan stamcellsegenskaper och behöver inte ektopisk induktion av pluripotens. Dessutom uppvisar AFS-cellerna redan stamcellernas epigenetiska mönster. Sammanfattningsvis är det inte förvånande att många försök för närvarande fokuserar på frågan under vilka förhållanden AFS-celler skulle kunna användas för stamcellsbaserade terapier. Dessutom blir AFS-celler för närvarande alltmer accepterade som ett optimalt verktyg för grundforskning.
Även om ES-celler, iPS-celler och AFS-celler anses ha en pluripotent differentieringspotential är frågan om de uppvisar samma kvalitativa spektrum av differentieringspotential fortfarande obesvarad. Pluripotenta stamceller definieras som självreplikerande celler (cellerna kan dela sig i sig själva) som är kända för att ha förmågan att utvecklas till celler och vävnader i de primära könsskikten, ektoderm, mesoderm och endoderm. Dessa tre stamcellstyper (ES-, iPS- och AFS-celler) har visat sig ha potential att differentiera sig till celler i de tre könsskikten. Alla tre kan också bilda embryokroppar. Huruvida de verkligen har jämförbara möjligheter att differentiera sig till en specifik celltyp med alla dess kända biologiska funktioner måste dock prövas från fall till fall. Vi anser faktiskt att det är nödvändigt att direkt undersöka och jämföra deras differentieringspotential och välja ut de mest lämpliga celltyperna för grundforskningsprojekt och för den förmodade användningen i nya stamcellsbaserade terapier. Dessutom bör en uppenbar skillnad mellan dessa tre pluripotenta stamcellstyper undersökas närmare i framtiden. Sedan den första beskrivningen av deras in vitro-odling har ES-celler varit kända för att vara tumörigena. På samma sätt inducerar iPS-celler tumörbildning när de transplanteras subkutant i nakna möss. Det har dock rapporterats att AFS-celler inte bildar tumörer i svåra kombinerade immunbristfälliga möss. Eftersom det sistnämnda hittills bara har studerats i ett projekt där man analyserat en specifik uppsättning djurtransplantationer, är det motiverat med ytterligare undersökningar för att klargöra om AFS-celler verkligen inte är tumörframkallande. Om det stämmer skulle detta naturligtvis vara en viktig fördel jämfört med ES- och iPS-celler, åtminstone när det gäller en möjlig klinisk användning.
2. AFS-celler för terapi: Mycket av spänningen kring mänskliga stamceller hänger samman med klinikers och patienters förhoppningar om att dessa celler en gång kan användas för cellterapier för ett brett spektrum av mänskliga sjukdomar. Här måste det tydligt sägas att arbetet med AFS-cellbaserade terapier fortfarande är i sin linda. Många frågor är för närvarande under utredning, och hittills har ingen terapeutisk metod baserad på AFS-celler nått nivån för klinisk rutintillämpning. En rad nya forskningsresultat ger dock starka bevis för att AFS-celler verkligen skulle kunna fungera som ett kraftfullt verktyg inom regenerativ medicin .
Akut och kronisk njursvikt är till exempel sjukdomar med hög sjuklighet och dödlighet. Njurtransplantation är fortfarande det mest effektiva behandlingsalternativet för majoriteten av patienter med njursjukdom i slutskedet. Tyvärr är bristen på kompatibla organ en mycket begränsande faktor. Behandlingsstrategier bygger också på konventionell njurdialys, men dödligheten hos patienter som behöver kronisk dialys är hög. Följaktligen kom den förmodade användningen av stamceller vid reparation av njurskador i fokus. Flera nyligen publicerade studier om njurdifferentiering av AFS-celler gör det frestande att spekulera i att dessa stamceller en gång skulle kunna betraktas som en ny lovande källa för cellbaserade terapier för att reparera njurskador och motiverar ytterligare undersökningar i denna riktning. Med hjälp av en njurreaggregationsanalys har vi nyligen publicerat att AFS-celler har potential att differentiera sig till nefrogena linjer och att denna kapacitet beror på signalvägen mTOR (mammalian target of rapamycin) (se även diskussionen nedan). Andra har visat att humana AFS-celler kan integreras i njurvävnad när de injiceras i isolerade embryonala njurar från muriner eller att injektion av AFS-celler i skadade njurar hos möss med rhabdomyolysrelaterad akut tubulär nekros kan ge en skyddande effekt . Även om dessa och andra uppgifter gör det frestande att spekulera i att AFS-celler kan utgöra framgångsrika alternativa metoder för behandling av till exempel akut tubulär nekros, måste många fler frågor besvaras innan sådana cellbaserade terapier kan övervägas för rutinmässiga tillämpningar på människor.
Av många olika anledningar är det också av stort intresse att skapa nya stamcellsbaserade terapier för hittills obotliga patologier i det centrala nervsystemet, till exempel Parkinsons sjukdom, ryggmärgsskador, multipel skleros eller stroke. Neurala stamceller, som har undersökts för detta ändamål, kan hittas i det vuxna centrala nervsystemet och i embryot under utveckling, men dessa vävnader är inte lätt tillgängliga och ger upphov till etiska problem. Under de senaste åren har olika grupper rapporterat om den neurogena differentieringspotentialen hos AFS-celler. Innan nästa steg i riktning mot klinisk användning av AFS-cellbaserade metoder kan övervägas måste dock bevisen för att AFS verkligen kan bilda mogna neuroner tillhandahållas. Faktum är att det fortfarande pågår en debatt i litteraturen om huruvida AFS-celler verkligen kan bilda funktionella neuroner. Inom en nära framtid kommer det att vara mycket viktigt att ta reda på vilken typ av neurogena celltyper som kan utvecklas från AFS-celler. Frågan om AFS-celler kan differentiera till funktionella mogna neuroner måste undersökas genom att analysera förmågan att avfyra tetrodotoxin-känsliga aktionspotentialer med den karakteristiska formen och varaktigheten eller genom att påvisa synaptisk kommunikation med hjälp av elektronmikroskopi .
Här skulle det vara möjligt att diskutera några fler exempel på tänkbara terapeutiska tillvägagångssätt med hjälp av AFS-celler. Ibland hävdas det att många grundläggande frågor om ursprung, tumörigenicitet, differentieringspotential, epigenetisk status eller genomisk stabilitet måste undersökas innan AFS-celler kan övervägas som ett terapeutiskt verktyg. Vi anser dock att alla dessa aspekter bör studeras parallellt. För framtida överväganden är det dessutom verkligen viktigt att kvantitativt och kvalitativt jämföra alla dessa egenskaper hos AFS-celler med dem hos andra pluripotenta eller vuxna stamcellstyper.
3. AFS-celler i grundläggande vetenskap: Framtida perspektiv
Stamceller är mycket användbara verktyg för att studera den molekylära och cellulära regleringen av differentieringsprocesser. Ett tillvägagångssätt för att lära sig mer om den roll som till exempel en specifik gen spelar för en viss differentieringsprocess är att slå ner det endogena uttrycket av genen av intresse. En sådan metod gör det möjligt att klargöra vilken roll det modulerade genuttrycket spelar för cellens potential att differentiera sig till en viss linje. Vi har nyligen publicerat ett protokoll för effektiv siRNA-medierad långvarig tystnad av gener i AFS-celler . Detta protokoll, som vi redan har testat för en rad olika gener, möjliggör en 96-98-procentig nedreglering av det endogena genuttrycket under en tidsperiod på cirka 14 dagar i AFS-celler och i en rad andra primära, odödliga eller transformerade celler .
Nyligen har vi använt oss av detta tillvägagångssätt för att studera mTOR-vägens roll i mänskliga AFS-celler. Deregulering av uppströmsreglerare av mTOR, som till exempel Wnt, Ras, TNF-α, PI3K eller Akt, är ett kännetecken för många mänskliga cancerformer. Mutationer i mTOR-banans komponentgener TSC1, TSC2, LKB1, PTEN, VHL, NF1 och PKD1 utlöser utvecklingen av mänskliga genetiska syndrom: tuberös skleros, Peutz-Jeghers-syndromet, Cowden-syndromet, Bannayan-Riley-Ruvalcaba-syndromet, Lhermitte-Duclos-sjukdomen, Proteus-syndromet, von Hippel-Lindau-sjukdomen, neurofibromatos typ 1 och polycystisk njursjukdom. Förutom en rad olika sjukdomar med enskilda gener och tumörutveckling har mTOR-systemet också visat sig ha betydelse för utvecklingen av komplexa sjukdomar, t.ex. hjärthypertrofi, fetma och typ 2-diabetes. Alla dessa patologiska konsekvenser av en avreglerad mTOR-aktivitet kan förklaras med tanke på att mTOR är en nyckelkomponent i insulinsignalkaskaden, som är involverad i ett stort antal olika processer, t.ex. celltillväxt, proliferation, ämnesomsättning, transkription, översättning, överlevnad, autofagi, åldrande, differentiering och onkogenes . Vi fann att hela processen för bildandet av embryokroppar i AFS-celler är beroende av de båda mTOR-innehållande enzymerna mTORC1 och mTORC2 . Som nämnts ovan visade modulering av mTOR-komponenter via specifika siRNA-strategier att AFS-cellernas potential att bidra till bildandet av njurvävnad regleras av denna signalväg . Nyligen kunde vi med hjälp av metoden att slå ned endogena genfunktioner i AFS-celler upptäcka att de två mTOR-regulatorerna tuberin och PRAS40 är antiapoptotiska portvakter under den tidiga differentieringen av mänskliga AFS-celler . Sammantaget anser vi att siRNA-medierad knockdown av endogent genuttryck i monoklonala mänskliga AFS-cellinjer är ett mycket kraftfullt verktyg för framtida projekt som handlar om den molekylära regleringen av differentiering .
En annan mycket intressant aspekt för framtida grundforskning är att samla in AFS-cellinjer som bär på naturligt förekommande mutationer, vilka är relevanta för vissa patologiska fenotyper hos människor. Inom medicinsk genetik är den framtida utvecklingen av nya profylaktiska och terapeutiska strategier direkt beroende av en bättre förståelse av de mekanismer genom vilka naturligt förekommande genetisk variation bidrar till sjukdom . I länder där det är lagligt att använda mänskliga embryon för forskning genereras ES-cellinjer som bär på vissa ärftliga defekter från embryon med alla typer av numeriska kromosomavvikelser eller specifika monogena sjukdomsmutationer som uteslutits från överföring till livmodern efter preimplantatorisk genetisk diagnostik . Det har också redan genererats en mängd iPS-linjer från enstaka genetiska störningar, kromosomsyndrom och komplexa sjukdomar i syfte att använda dem för grundforskningsprojekt . Som redan diskuterats i detalj har dock både ES-celler och iPS-celler relevanta nackdelar jämfört med AFS-celler. Vid sidan av andra invasiva metoder är fostervattenprov ett allmänt accepterat standardförfarande för prenatal vård sedan 1970-talet. Det är nästan oförutsägbart hur många fostervattenprov som utförs i världen per år. Sammantaget anser vi att generering och lagring av normala mänskliga AFS-cellinjer och AFS-cellinjer med kromosomavvikelser samt AFS-cellinjer med specifika monogena sjukdomsmutationer skulle kunna ge mycket kraftfulla verktyg för sjukdomsmodellering i framtida forskning. Här är det viktigt att notera att bankning av AFS-celler för icke-forskningsändamål, i syfte att skydda ett barns hälsa genom att ha stamceller tillgängliga under hela hans eller hennes livstid, är något annat. Vissa företag i Europa och USA erbjuder redan bankning av AFS-celler när till exempel en fostervattenprovtagning utförs för fosterdiagnostik. Deras argument för att bevara AFS-celler är att dessa celler en gång skulle kunna hjälpa till att behandla skador (t.ex. reparera brosk för knäet), läka sår eller utveckla hud för specifika transplantat. Som tidigare nämnts krävs det i framtiden omfattande forskning för att fastställa den förmodade kliniska användningen av AFS-stamceller hos människor. De lovande resultat som uppnåtts under de senaste åren inom detta ännu unga vetenskapliga område motiverar helt klart ytterligare detaljerade undersökningar av AFS-cellernas förmodade kliniska tillämpning. I den här artikeln vill vi betona att bankverksamhet med AFS-celler med naturligt förekommande mutationer för genetisk forskning på människor bör påbörjas så snart som möjligt i olika laboratorier med jämförbara kvalitetsstandarder. Det skulle vara värt att uppmuntra olika laboratorier att ta prov på fostervatten från fostervattenprov med jämförbara indikationer från liknande graviditetsveckor. Protokollen för att isolera stamceller, utföra minimala utspädningar och karakterisera de monoklonala AFS-cellinjer som erhållits på detta sätt bör standardiseras. Biobanker av AFS-cellinjer med karakteriserade mutationer skulle göra det möjligt att gå vidare till nästa steg i den humangenetiska forskningen med hjälp av mänskliga stamceller .