Autotomi tycks ha utvecklats flera gånger bland däggdjur, men är taxonomiskt sett sparsamt förekommande. Dokumenterad autotomi är vanligtvis begränsad till svansen och sker genom förlust av svansskidan (falsk autotomi) eller genom brott över kotan (äkta autotomi)2,5. Förutom svansautotomi har tillfälliga hänvisningar gjorts till däggdjursarter med svag eller bräcklig hud, även om det fortfarande är okänt om dessa djur är kapabla till hudautotomi. Därför försökte vi först undersöka anekdotiska bevis för att två arter av afrikansk taggmus (Acomys kempi och Acomys percivali) lätt tappar delar av sin hud som ett beteende för att undkomma rovdjur.
För att testa hypotesen att A. kempi och A. percivali är kapabla till hudautotomi, fångade vi individer med levande fällor på klippiga utskjutningar (kopjes) i centrala Kenya. Utöver skyddshåren utmärker sig arter i släktet Acomys för förekomsten av taggliknande hår på ryggraden (fig. 1a, b). Hantering av båda arterna i fält bekräftade att kraftiga rörelser ofta ledde till att huden slets sönder. Avslitningen resulterade i stora öppna sår eller hudförlust som varierade från små bitar till områden som motsvarade ungefär 60 % av den totala ryggytan (fig. 1c). Förutom förlusten av integumentet uppvisade båda arterna autotomi av svansskidan, vilket tidigare rapporterats för andra Acomys-arter, och individer fångades ofta med saknade svansar2. Bland individer i fångenskap observerade vi att allvarliga hudsår läkte snabbt och att den snabba återväxten av taggiga hårstrån helt dolde det skadade området (fig. 1d, e). Fältinfångade individer visade liknande läkning och i vissa fall mönstrade hårsäckar i anagen (dvs. tillväxtfasen) som verkade ha förnyats i de skadade områdena (fig. 1f).
(a-b)A. kempi (a) och A. percivali (b) har styva, taggiga, taggliknande hår på dorsum. (c)A. kempi efter förlust av dorsalskinnet. (d-e) Skorpbildning efter hudskada med full tjocklek som är synlig vid D3 (d). Samma sår i (d) är inte längre synliga vid D30 och nya taggiga hårstrån täcker det skadade området (e). (f) Helande sår på ett fältfångat exemplar som visar nya hårsäckar i sårbädden. Skalstreck = 1 cm.
För att utvärdera hur Acomys hud kan rivas så lätt frågade vi oss om de mekaniska egenskaperna hos Acomys hud kan ligga bakom dess observerade svaghet. Baserat på experiment som undersöker hudautotomi hos geckos3 kan svag hud (dvs. hud som besitter enhetliga strukturella egenskaper som sviktar eller går sönder vid relativt låg inducerad belastning) särskiljas från bräcklig hud (dvs. hud som besitter specifika morfologiska karakteriseringar, t.ex. ett frakturplan som gör det möjligt för de yttre lagren att lossna). För att bedöma hudens svaghet jämförde vi de mekaniska egenskaperna hos Acomys- och Mus-hud. Vid mekanisk belastning uppvisade Mus-huden elastiska egenskaper innan den gick sönder, medan Acomys-huden var spröd och började rivas kort efter det att belastningen hade lagts på (fig. 2a). Vi tog fram spännings- och töjningskurvor från dorsalskinnet för att bestämma den genomsnittliga draghållfastheten (σm) och fann att Mus-skinnet var 20 gånger starkare än Acomys-skinnet (2,3 MPa ±0,19 och 0,11 MPa ±0,03) (fig. 2a, b). När man slutligen beräknade den genomsnittliga segheten (W) krävdes nästan 77 gånger mer energi för att bryta Mus-hudet än Acomys-hudet (fig. 2b). Dessa resultat visar att Acomys har en hud som lätt slits (eller går sönder) som svar på låg påförd spänning och ger en mekanisk grund för hudens svaghet.
(a-b) Spännings- och töjningskurvor för Mus n=6, A. kempi n=5, A. percivali n=5, beskrivna fram till brottsbelastningen (a) och för en individ (b) som approximerar den verkliga genomsnittliga draghållfastheten (σm) och den genomsnittliga segheten (W) (representerade som skuggade områden). (c-d) Massons trikromfärgning av oskadad rygghud från M. musculus (c) och A. percivali (d). (e-f) Procent adnexa (t.ex. hårsäckar och tillhörande körtlar) i dermis (gul skuggning) hos Mus (e) och A. percivali (f). (g) Cytokeratinfärgade keratinocyter (gul pil) som just börjat migrera i små sår vid D3 hos Mus. (h) Helt återepiteliserade sår hos Acomys vid D3. Tid efter skadan i dagar. WM = sårkant. Insatser visar det relativa sårläget för den avbildade vävnaden. (i-l) Picrosirius röd färgning av små sår hos Mus (i, k) och A. percivali (j, l). Bifringen av picrosiriusfärgen (k, l) skiljer tjocka kollagen typ I-fibrer (röd/orange) från tunna kollagen typ III-fibrer (grön). Kollagenfibrerna i Mus är huvudsakligen av typ I, tätt packade och löper parallellt med epidermis (k). Kollagenfibrerna hos A. percivali är mer porösa med en större andel kollagen typ III (l). Skalstreck = 100 µm.
För att utvärdera om de strukturella egenskaperna hos Acomys hud bidrog till dess mekaniska svaghet undersökte vi de cellulära egenskaperna hos A. percivali hud och fann att den var anatomiskt jämförbar med Mus och andra gnagare, om än med mycket större hårsäckar (fig. 2c, d). Vi fann inga tecken på ett brottplan, vilket är mekanismen för hudens autonomi hos geckos och skinks3. När vi undersökte elastinfibrerna, som ökar hudens elasticitet, fann vi att alla tre arter hade en liknande fördelning och rikedom av elastin i dermis och under panniculus carnosus (Fig. S1a-f). Vi testade om större hårsäckar i Acomys hud minskade den totala dermala ytan som upptas av bindväv genom att undersöka andelen adnexa (t.ex. hårsäckar och tillhörande körtlar) inom dermis och fann att den var större hos A. percivali (55,61 % ±4,28) jämfört med M. musculus (43,65 % ±4,62) (t=1,9, P=0,043) (fig. 2e, f). Dessa resultat tyder på att även om den grundläggande vävnadsstrukturen i Acomys hud liknar Mus, minskar det utrymme som upptas av adnexa i dermis det absoluta bindvävsinnehållet, vilket potentiellt kan bidra till den minskade elasticiteten och den lägre draghållfastheten när huden sätts under spänning6. Avsaknaden av ett frakturplan understryker detta fynd och stöder en inneboende strukturell skillnad som ligger till grund för den observerade svagheten hos Acomys hud.
Med tanke på dess inneboende strukturella svaghet och benägenhet att riva, bedömde vi Acomys förmåga att läka hudsår med hjälp av små (4 mm) och stora (1,5 cm), full tjocklek excisionellativa (FTE) sår. I sår av båda storlekarna var bildandet av skorv och hemostas snabbt, och i stora sår bidrog det till en minskning av sårytan med 64 % ± 3,1 % 24 timmar efter skadan (Fig. S2a). Under ärrfri läkning hos terrestriska salamandrar7 och däggdjursfoster8 återepiteliseras sårbädden inom flera dagar, medan ett 4 mm stort sår i huden på en vuxen råtta tar mellan 5-7 dagar att återepiteliseras9. Hos Acomys fann vi att fem av sex 4 mm-sår hade återepiteliserats helt och hållet vid dag 3 efter skadan (D3), medan Mus-såren inte återepiteliserades så snabbt (fig. 2g, h). Efter återepitelisering förlitar sig däggdjur med löst skinn (t.ex. gnagare, kaniner osv.) främst på kontraktion för att läka sina sår10. På samma sätt observerade vi höga kontraktionshastigheter, som stod för 95 % av sårförslutningen efter 17 dagar (fig. S2a-c). Till skillnad från ärrbildning, där kollagenfibrerna organiserar sig i ett tätt nätverk parallellt med epidermis, antar kollagenfibrerna under ärrfri läkning ett mönster som liknar oskadad dermis10. När vi undersökte den extracellulära matrisen (ECM) vid D10 observerade vi ärrbildning hos Mus medan kollagenfibrillerna hos Acomys var mindre tätt packade och innehöll en mer porös struktur (fig. 2i, j). Med hjälp av picrosiriusrött fann vi att kollagen typ I dominerade sårbädden vid D10 hos Mus, medan kollagen typ III fanns i större mängd hos Acomys (fig. 2k, l). Denna skillnad var ännu tydligare i 1,5 cm långa sår (fig. S3a-b’). Tillsammans visar dessa data att snabb återepitelisering och sammandragning av sårkanten kraftigt minskar storleken på öppna hudrevor hos Acomys. Våra resultat, att sårets ECM (1) deponeras långsamt, (2) har en porös konfiguration och (3) domineras av kollagen typ III, tyder på att denna sammansättning gynnar regeneration framför fibros under hudreparation hos Acomys.
För att testa sårmiljöns regenerationsförmåga tog vi prover från stora läkningssår för att se om det fanns tecken på nybildning av hårsäcksfolliklar och regeneration av dermen. I samband med den mer porösa ECM:n observerade vi follikelgenesering av normala pelagehår och stora tagghår i sårbädden mellan D21 och D28, och vi kunde skilja gamla, stora folliklar nära sårkanterna från nyregenererade folliklar i sårbädden (fig. 3a-d och fig. S3c-e). Nya folliklar verkade regenerera i hela den okontraherade delen av sårbädden, inte bara i den centrala regionen (fig. 3c och fig. S3e) och vi observerade regenererande hårsäckar i olika utvecklingsstadier (fig. 3a-m och fig. S4a-c). En lokaliserad och starkt proliferativ population av epidermala celler driver hårsäcksutvecklingen och vi observerade ett liknande fenomen under follikelregenerering (fig. 3e och fig. S4a-c). För att undersöka om embryonala signalnätverk som används under hårfollikelutvecklingen användes under hårfollikelregenerering undersökte vi Keratin-17 (Krt17); som uttrycks diffust i epidermis under hudens utveckling och blir successivt begränsat till utvecklande hårfolliklar11. Efter återepitelisering var KRT17 starkt anrikad i hela neoepidermis som låg över sårbädden vid D14 och när nya hårsäckar bildades i sårbädden begränsades KRT17 till follikelepitelet (fig. 3f och fig. S5). Under sårreparation i Mus fann vi att KRT17 också var starkt uppreglerad i den återepiteliserade epidermis vid D14 (Fig. S5) och även om KRT17 lokaliserades till vissa basala keratinocyter i Mus epidermis vid D21, misslyckades dessa platser med att aggregera till placoder eller nya hårsäckar så att KRT17 helt saknades i den nya epidermis vid D26 (Fig. 3f). Försvinnandet av KRT17 från basala keratinocyter i Mus, tillsammans med vår observation av fortsatt lokalisering i nya placoder och hårsäckar i Acomys, tyder på att de underliggande dermala signaler som krävs för att inducera placodebildning i Mus saknas.
(a-d) Hårsäckar som regenereras hos A. percivali (gula pilar) mellan D21 och D28 i stora hudsår. Dagarna är dagar efter skadan. Nya hårsäckar (gula pilar) finns i hela sårbädden (rött streckat område) vid D28 (c-d). Gröna pilar visar gamla hårsäckar. WM = sårkant. (e-k) Regenererande hårsäckar uttrycker proteiner som är associerade med utveckling och differentiering; Ki67 markerar prolifererande hårspiror (e), Keratin-17 (gula pilar) hos Acomys, men saknas hos Mus vid D26 (f), kärnlokaliserad LEF1 i follikelplacoder (g) och senare i dermala papillaceller (dp) och omgivande matrixceller (mx) (h), fosforylerad SMAD 1/5/8 (som en avläsning av Bmp-signalering) i epidermala hårspårceller (i) och senare i dermala papillaceller (dp) och matrisceller (mx) i regenererade folliklar (j), och Sox2 i dermala papillaceller (k). Skalstreck = 100 µm, utom (e) = 50 µm.
Och även om den exakta signalen för placode-bildningen fortfarande är oklar, finns det ett absolut krav på Wnt-signalering under normal follikelbildning12. Kärnlokalisering av LEF1-proteinet har använts som en avläsning av denna induktiva signalering13. Vi upptäckte nukleär ackumulering av LEF1 i regenererande epidermala placoder, kondenserande dermala fibroblaster under hårspiran och i dermala papill- och matrisceller (fig. 3g, h och fig. S6a). Vi upptäckte också nukleär LEF1-färgning på låga nivåer i vissa basala keratinocyter som inte är placoder, medan vi inte upptäckte nukleär LEF1 i epidermis under sårläkning hos Mus, vilket tyder på att epidermal Wnt-aktivering hos Acomys delvis kan ligga till grund för våra observationer av regeneration av hårsäckar (Fig. S6b, c).
Regulering av kanonisk Bmp-signalering spelar också en roll under induktion av hårsäckar och differentiering av follikulära progenitorpopulationer till den mogna hårsäcken (granskad i14). Fosforylering av SMAD 1, 5 och 8 (pSMAD1/5/8) är en robust avläsning av kanonisk Bmp-signalering. Vi upptäckte pSMAD1/5/8 på låga nivåer under follikelinduktion och senare på högre nivåer i dermal papilla och matrisceller som genomgår differentiering i hårbulben (fig. 3i, j). Dessutom upptäckte vi SOX2-positiv dermal papilla i vissa regenererande hårsäckar, vilket stämmer överens med dess roll i specificeringen av olika hårtyper under utvecklingen av hårsäckar hos musen15 (fig. 3k). Sammantaget visar dessa resultat att regenererande hårsäckar hos Acomys går igenom definierade stadier av hårsäcksutveckling, uppvisar hög proliferation och återanvänder molekylära vägar som används under den embryonala hårsäcksutvecklingen för att regenerera nya hårsäckar.
Vuxna däggdjurs hud är normalt oförmögen att regenerera epidermalt härledda strukturer som svar på sår (t.ex. körtlar och hårsäckar). Ett undantag från detta är observationen av spontan follikelgenes i stora excisionssår hos kaniner, och på senare tid hos laboratoriemöss (C57BL6/SJ, SJL eller blandade stammar)16,17,18. Kaniner är också en av de få däggdjursarter som kan regenerera stora öronstanssår19. Vi antog att den regenerativa förmåga som observerats hos Acomys skulle kunna utsträckas till deras öronvävnad också. För att testa detta gjorde vi 4 mm stora hål genom öronen på båda Acomys-arterna och fann till vår förvåning att de kunde stänga dessa stora hål (fig. 4a-c och fig. S7a-c). Oskadad öronvävnad innehåller hud (epidermis och dermis), tillhörande hårsäckar, fettceller, muskler och brosk. Vi fann att Acomys var kapabla att helt återskapa alla dessa vävnader med hög tillförlitlighet utom muskler (fig. 4b-c). Tolv dagar efter skadan observerade vi en ackumulering av celler runt omkretsen av såret under epidermis och även om regenereringen av ny vävnad var centripetal, ackumulerades cellerna i större utsträckning på den proximala sidan av stansen. Hårfollikel- och broskregenerering fortsatte i en proximal till distal våg (fig. 4d, e) och i likhet med huden aktiverade follikelepidermis i örat Wnt-signalering (fig. S6d, e). Till skillnad från Acomys fann vi att Mus var oförmögen att regenerera 4 mm stora öronstansningar och i stället bildade ärrvävnad (fig. S8a, b). Intressant nog resulterade Mus reparation av örat, trots ärrbildning, i en de novo-bildning av broskkondensationer distalt från det skurna brosket, vilket tyder på att Mus kan initiera, men inte bibehålla, ett regenerativt svar efter öronsår (fig. S8b).
(a) Regenererad 4 mm stor öronstansning hos A. percivali. (b) Oskadad vävnad i Acomys öronpinna. (c) Regenererad dermis, hårsäckar, brosk och fettvävnad i biopsiutstansat område. Dagarna är dagar efter skadan. Vit cirkel = ursprungligt stansat område. (d) Regenererande hårsäckar (gula pilar) och brosk (gröna pilar) differentieras proximalt till distalt. (e) Safranin-O/Fast Green indikerar kondrogenes (gröna pilar). (f-i) Prolifererande celler (Ki67+) i tidiga (f-g) och sena (h-i) Acomys- och Mus-öron. Proliferationen är begränsad proximalt till sårepidermis (WE) (röda pilar) i Acomys (f) och är kontinuerlig i basala keratinocyter i Mus (g). Proliferationen bibehålls i Acomys vid D32 (h) och mycket få prolifererande celler finns kvar i Mus (i) (röda pilar). (j-l) Kollagen IV-färgat moget basalmembran saknas under sårets epidermis hos Acomys (j), men finns nära amputationen (k) och distalt hos Mus (l). Gula pilar visar basalmembran, e=epidermis och vita parenteser visar epidermal tjocklek. (m-n) Nästan inga αSMA-positiva fibroblaster finns i Acomys (m) medan αSMA-positiva myofibroblaster finns i det läkande Mus-örat (n). Insatsen visar stressfibrer i enskilda myofibroblaster. (o) TN-C försvinner där nytt brosk differentieras (vita pilar) i Acomys. Gula/gröna celler (j-o) är autofluorescerande blodceller i GFP-kanalen. Skala staplar = 100 µm.
Det är fortfarande oklart om regeneration hos däggdjur sker genom bildning av ett blastema eller om det i stället är en överdriven version av hyperplastisk tillväxt20,21,22. Blastema-bildning anses vara ett kännetecken för epimorfisk regeneration. Ett kännetecken för ett regenerationsblastema är att det innehåller prolifererande celler och upprätthåller proliferationen under regenerationen23. Vi observerade en utbredd proliferation i hela det regenererade örat hos Acomys och överraskande nog i hela den läkande öronvävnaden hos Mus (fig. 4f, g). Vi noterade dock en brist på proliferation i den distala epidermis hos Acomys, medan vi upptäckte proliferation i hela Mus epidermis som sträckte sig till den distala spetsen (fig. 4f, g). Medan proliferationen bibehölls i Acomys öron observerade vi nästan inga prolifererande celler i Mus öron i senare stadier (Fig. 4h, i).
En annan egenskap hos ett blastema är bildandet av ett specialiserat epidermalt signalcentrum (sårepidermis) som krävs för att prolifererande blastemaceller ska kunna stanna kvar i cellcykeln24 och som kännetecknas av en förlust av epidermal stratifiering, förlust av basal keratinocytpolaritet och avsaknad av en mogen basal lamina25. Efter återepitelisering hos Acomys noterade vi en förtjockning av den distala epidermis, desorganisering av basala keratinocyter och avsaknad av ett moget basalmembran (Fig. 4j). Jämförelsevis uppvisade epidermis nära amputationsplanet normal stratifiering och hade ett framträdande basalmembran (Fig. 4k). Däremot tycktes Mus bilda en sårepidermis endast övergående efter återepitelisering, med ett proportionellt mindre distalt område som uppvisade dessa egenskaper under en kort tid (data visas inte). Vid D12 hos Mus visade färgning av kollagen typ IV ett moget basalmembran under hela epidermis i det läkande örat (fig. 4l). Dessutom uppvisade epidermis normal stratifiering och korrekt apikal-basal polaritet hos de basala keratinocyterna (fig. 4g, l).
Inom den uthålliga proliferationen och bildandet av sårets epidermis spelar extracellulära matrismolekyler (ECM-molekyler) en nyckelroll när det gäller att stödja proliferationen och styra den efterföljande differentieringen under regenereringen26. Däremot nedregleras molekyler som laminin och kollagen typ I, som gynnar differentiering, i blastemet under regenerering av amfibiernas lemmar och uttrycks när differentieringen av muskuloskeletala systemet fortskrider26,27. Histologisk undersökning av Acomys öron vid D12 visade höga nivåer av fibronectin (FN), en del tenascin-C (TN-C) som omger tätt packade celler, men mycket låga nivåer av kollagen typ I (fig. S9a-c). Kollagen typ III var också rikligare än kollagen typ I under regenerationen (fig. S9d-d’). TN-C begränsades från områden där nytt brosk började differentieras och inom dessa differentierande celler fann vi aktivering av Bmp-signalvägen i celler som ger upphov till nytt öronbrosk (fig. 4o och fig. S10). Under den hyperplastiska tillväxten i Mus-öron uppvisade ECM till en början höga nivåer av FN och låga nivåer av TN-C liksom Acomys-öron, men producerade relativt sett högre nivåer av kollagen typ I (Fig. S9e-g). Kollagenproduktionen i Mus var inte bara snabbare och rikligare, utan uppvisade också en högre kvot mellan kollagen typ I och III (Fig. S9h, h’). Med tanke på den överdrivna produktionen av kollagen typ I i Mus frågade vi oss om residenta fibroblaster differentierades till myofibroblaster, som bidrar till ärrbildning i stället för regeneration (granskad i28). Med hjälp av alfa smooth muscle actin (αSMA) fann vi myofibroblaster i stor mängd i hela öronvävnaden hos Mus, medan de nästan helt saknades i Acomys öron (fig. 4m, n). Dessa data bekräftar vikten av sårets ECM för att främja proliferation samtidigt som differentiering motverkas och stöder tidigare arbete som visar att tidig kollagen typ I-bildning motverkar appendage-regenerering27.
Våra data tyder på att reparativ öronregenerering hos Acomys är en balans mellan för tidig reformation av dermis (ärrbildning) och upprätthållande av cellproliferation inom en pro-regenerativ miljö. Mus misslyckas däremot med att bilda (eller bibehålla) en sårepidermis, vilket sammanfaller med tidig bildning av basalmembranet och stratifiering av epidermis. Detta leder till minskad cellproliferation, ökad kollagen typ I-avlagring (i stället för kollagen typ III), aktivering av myofibroblaster och slutligen ärrbildning. Även om våra data tyder på att öronregenerering har liknande egenskaper som blastema-bildning, är det avgörande att förstå de molekylära signaler som krävs för att organisera och bibehålla en sårig epidermis och identifiera de regenererande cellernas härstamning för att kunna ta reda på hur regenerering sker hos dessa djur. Framtida arbete som undersöker hur Acomys kan kontrollera fibros kommer att kasta ljus över hur regeneration och ärrbildning kan balanseras inför infektion och inflammation hos vilda däggdjur och utgör ett idealiskt modellsystem för att undersöka epimorfisk regeneration hos däggdjur.