Abstract
Syfte. Att klargöra effekten av Lactobacillus plantarum 299v på salivkortisol- och saliv-IgA-nivåerna hos unga vuxna som utsätts för examinationsstress. Design. Fyrtioett studenter med en kommande akademisk tentamen ingick i en randomiserad dubbelblind, placebokontrollerad studie. Den probiotiska bakterien eller placeboprodukten administrerades i kapslar en gång om dagen under 14 dagar. Saliv samlades in och ett test för upplevd stress fylldes i vid varje provtagningstillfälle. Saliv samlades in för kortisolanalys med hjälp av elektrokemiluminiscensimmunoassay (ECLI) och saliv-IgA analyserades med hjälp av enzymkopplad immunosorbentassay (ELISA). Mängden laktobaciller utvärderades genom odling av saliv på selektivt medium och identifiering av L. plantarum 299v gjordes på slumpvis utvalda kolonier med hjälp av RAPD-typning (random amplification of polymorphic DNA). Resultat. En signifikant skillnad i kortisolnivåer hittades mellan behandlingsgruppen och placebogruppen (), tillsammans med en signifikant ökning av nivåerna av laktobaciller i behandlingsgruppen jämfört med placebogruppen (). Inga signifikanta förändringar hittades för IgA i saliven. Slutsats. En probiotisk bakterie med förmåga att minska symtom på irritabel tarm (IBS) förbjöd ökade nivåer av stressmarkören kortisol under undersökningsperioden. Studiens registreringsnummer är NCT02974894 och studien är registrerad på ClinicalTrials.gov.
1. Introduktion
Det finns ett samband mellan matsmältningskanalen och fysiologisk stress och salivkortisol och salivimmunoglobulin A (saliv-IgA) kan tas som stressmarkörer . Kortisol är ett steroidhormon som frisätts av binjurarna som svar på stress och ökade nivåer har satts i samband med att immunförsvaret undertrycks . IgA i saliven är en del av det orala immunförsvaret och den vanligaste antikroppen i saliven, främst i form av sekretoriskt IgA . Mindre spottkörtlar, som är placerade över hela munslemhinnan, utsöndrar cirka 30-35 % av allt saliv-IgA som förekommer i vuxnas hela saliv .
Probiotika definieras som ”levande mikroorganismer som, när de administreras i adekvata mängder, ger en hälsofördel till värden” . L. plantarum 299v har i tidigare studier visat en positiv effekt på symtom på irritabelt tarmsyndrom (IBS) såsom uppblåsthet och smärta . Denna stam har också visat sig motverka läckage i tarmen, vilket i sin tur skulle kunna dämpa hypotalamus-hypofys- och binjureaxelns (HPA-axeln) reaktion på stress . Inga tidigare studier har genomförts om effekten av L. plantarum 299v på stressrelaterade tillstånd. Det har dock visats att en probiotisk blandning av Lactobacillus rhamnosus R0011 och Lactobacillus helveticus R0052 i råttungar som stressats av att skiljas från sina mödrar signifikant minskade nivåerna av kortikosteron, kortisolanalogin, i blodet hos djuren . Dessutom blev råttor som utsattes för en akut tidsbegränsad stressor mindre stressade efter behandling med Lactobacillus farciminis , tillsammans med minskade nivåer av lipopolysackarider (LPS) i blodet .
Inte mycket är känt om effekterna av probiotiska bakterier på stressmarkörer i saliven, trots att salivprovtagning är en enkel och icke-invasiv metod som inte orsakar testpersonen någon skada eller obehag. Detta är särskilt viktigt vid utvärdering av stressmarkörer där en akut ökning kan bero på provtagningsmetoden och inte på den akuta stressfaktor som utvärderas i studien. När det gäller probiotiska effekter på IgA-nivåer i saliven är de flesta studier relaterade till förekomsten av olika luftvägsinfektioner , och i en tidigare studie rapporterades det att de sekretoriska IgA-nivåerna i avföringen ökade i en grupp barn som fick en produkt som innehöll L. rhamnosus HN001 jämfört med en placebogrupp . Liknande resultat uppnåddes med stammen L. rhamnosus GG .
Kronisk stress är relaterad till ökade kortisolnivåer, men huruvida kortisol är en orsak till de fysiologiska stressreaktionerna eller bara en konsekvens av dem är öppet för diskussion . Frisättningen av kortisol är ett fördröjt perifert svar på en akut stress och det föreslås att kortisol utövar både stimulerande och undertryckande verkan på kroppens stressreaktion. Ett exempel på en stimulerande verkan är utlösandet av den kardiovaskulära aktiveringen, men som svar på t.ex. en blödningsstressor undertrycker kortisol den minskade vätskevolymresponsen genom att hämma den initiala snabba utsöndringen av vasokonstriktiva stresshormoner . När det gäller kortisols immunreglerande egenskaper föreslås dess sekretion skydda mot den ”överskridande” av immunsvaret som annars sker som svar på stress . Det är dock ännu inte klart vilka syften den ökade kortisolnivån tjänar under kroppens svar på stress .
I denna studie var huvudsyftet att klargöra effekten av den probiotiska bakterien Lactobacillus plantarum 299v på kortisolnivån i saliven hos unga vuxna som utsätts för undersökningsstress. IgA i spott från mindre körtlar och i hela människans saliv mättes som alternativa markörer för stress. Hypotesen var att kortisolnivåerna skulle minska eller stabiliseras i testgruppen jämfört med placebogruppen där kortisolnivåerna förväntades öka på grund av den examinationsinducerade stressen. Däremot förväntades IgA-nivåerna i saliven öka i testgruppen i jämförelse med placebogruppen.
2. Material och metoder
2.1. Studiedesign
I denna randomiserade, dubbelblinda placebokontrollerade studie deltog frivilliga studenter vid Lunds universitet, i åldrarna mellan 18 och 30 år, under sin tentamensperiod. Exklusionskriterier var graviditet samt intag av antibiotika och tillfällig kortisonmedicinering under studieperioden. En effektberäkning genomfördes för att bestämma antalet försökspersoner och 40 individer ansågs vara tillräckligt. 42 friska unga vuxna anmälde sig frivilligt till studien, 28 kvinnor och 14 män, och alla deltagare gav sitt undertecknade informerade samtycke till studien. Efter att en man hoppade av, fullföljde 41 personer hela försöksperioden. 21 fick testprodukten i en daglig dos av 1 1010 kolonibildande enheter av L. plantarum 299v i kapslar (L. plantarum 299v, potatisstärkelse, hydroxipropylmetylcellulosa och magnesiumstearat, (Probi AB, Lund, Sverige)) och 20 fick placebokapslar, som innehöll samma ingredienser som testprodukten med undantag för bakterierna. Innan försöksperioden inleddes fanns det en två veckors wash-out period då deltagarna instruerades att undvika intag av probiotiska produkter. Intag av kapseln skedde därefter en gång om dagen efter lunch och försökspersonerna ombads att inte äta, dricka, röka eller ta snus under en timme efter intaget. Deltagarna instruerades också att antingen tugga på kapseln tills pulvret löstes upp i munnen (minst 30 sekunder) eller tömma kapseln på en sked och tugga pulvret i 30 sekunder före intag. Referensproverna för alla deltagare samlades in dag 0, före intag av produkten. Studien pågick i 14 dagar och startdatumet bestämdes individuellt för alla deltagare, inom ett spann på 1,5 veckor.
2.2. Psykologisk bedömning
En psykologisk bedömning ingick för att försökspersonerna skulle kunna utvärdera sin självupplevda stress. Ett frågeformulär med 30 frågor utvecklat av Levenstein et al. användes och den erhållna lägre poängen indikerar en lägre grad av stress och vice versa. Ett index som ger ett tal mellan 0 och 1 beräknades enligt följande :
2.3. Provtagning av saliv
Minor gland saliv samlades in från de nedre labiala slemhinnorna enligt tidigare beskrivning och hela saliven skördades samma provtagningsdag. För att minska påverkan av cirkadiska variationer i salivsekretionen under insamlingen gjordes all provtagning mellan kl. 15.00 och 17.00. Alla prover samlades in dag 0 och dag 14, och dag 5 och 10 togs endast kortisolprover. Deltagarna instruerades att inte äta, dricka, ta snus, röka, borsta tänderna eller utöva någon form av motion en timme före provtagningstillfället. Alkohol var också förbjudet tolv timmar före provtagningstillfället.
2.4. Kortisolanalys
Provtagning av saliv för kortisolanalysen utfördes med en Salivette® för kortisol (Sarstedt, Tyskland) och den gjordes efter insamling av saliv för IgA-analys. Deltagarna instruerades att cirkulera salivet i munnen i 2-5 min, tills det var fyllt med saliv och sedan försiktigt spotta tillbaka det i röret. Rören lades på is och frystes senare in vid -20 °C fram till analysen. Kortisolanalysen utfördes av Labmedicin Skåne (universitetets och de regionala laboratorierna i Region Skåne, Sverige) och utfördes enligt ackreditering. Metoden som användes var en tävlingsanalys i ett steg med detektionstekniken Electrochemiluminescence Immunoassay (ECLI) baserad på ruthenium (Ru)-derivat .
2.5. Analys av IgA i saliv
Minor gland saliv samlades in från underläppen med en SialoPaper®-remsa (Oraflow Inc., New York, USA) och placerades försiktigt på slemhinnan i 60 s. Salivvolymen i remsan mättes med en Periotron® 8000 (Oraflow Inc., New York, USA). SialoPaper-remsan lades i 1 ml PBS (1,5 ml PP, Sarstedt, Tyskland; Phosphate Buffered Saline, Dulbecco A, Oxoid, England) på is och förvarades vid -80 °C fram till analysen. Den ostimulerade hela saliven samlades in efter provtagning av saliven från de mindre körtlarna. Deltagarna satt, lutade sig lätt framåt, och lät saliven rinna ner i ett 2 mL mikrorör med hjälp av ett sterilt sugrör (1 mL sterila engångspipetter, Kemikalia, Sverige; 2 mL PP, Sarstedt, Tyskland). Alla prover förvarades vid -80 °C fram till analysen.
Koncentrationen av IgA som utsöndras i saliven är relativ till den totala proteinmängden och därför väljs enheten % IgA/total protein för att representera resultatet av analysen av hela saliven. Detta är relevant eftersom IgA-sekretionen förändras med salivflödet, som i sin tur förändras med stimuli på det autonoma nervsystemet, t.ex. akut stress, kronisk stress och vila. Denna förändring i flödeshastighet redovisas genom att mäta % IgA/totalt protein i saliv, vilket gör det till en noggrann metod när man jämför data från olika försökspersoner .
För att analysera IgA-koncentrationen i saliven utfördes en modifierad sandwich-ELISA enligt Krzywkowski m.fl. med hjälp av α1- och α2-kedjespecifikt get-antikumant-IgA från människa (5 μg/ml, Sigma I0884; Sigma Chemical Co, St Louis, MO, USA) konjugerat till alkaliskt fosfatas (Sigma A9669; utspädd 1 : 30 000 i PBST). Den totala proteinkoncentrationen analyserades med en snabbstartproteinanalys (BIO-RAD) .
Saliv-IgA i saliven från den lilla körteln uttrycktes som mg/100 ml. Analysen av saliv-IgA utfördes vid Odontologiska fakulteten vid Malmö universitet (Malmö, Sverige).
2.6. Platträkning av laktobaciller
För att analysera de orala laktobacillerna tuggade försökspersonerna på en paraffinpellet (Orion Diagnostics) för att stimulera salivutsöndringen, och insamlingen skedde på samma sätt som för saliv-IgA i hela saliven. Insamlingen av detta salivprov gjordes i slutet av varje provtagningstillfälle, eftersom denna provtagningsmetod ger starkt stimulerad saliv, till skillnad från de andra metoderna. Rören ställdes på is och 0,25 mL av salivprovet överfördes till ett annat sterilt mikrorör (1,5 mL PP, Sarstedt, Tyskland) som innehöll 0,5 mL frysmedium. Båda rören sparades i -80°C fram till analysen.
Förekomsten av laktobaciller utvärderades genom platträkning. Proverna späddes ut och spreds på Rogosa agarplattor (Oxoid, England) och plattorna inkuberades vid 37°C i 72 timmar under anaeroba förhållanden (2,5 L, AnaeroGen™, Oxoid). Två kolonier från varje platta plockades slumpmässigt ut och återkultiverades. Isolaten frystes in och förvarades i frysmedia vid -80°C.
2.7. Identifiering av L. plantarum 299v
För DNA-extraktion av varje isolat tinades proverna upp och vortexades kort före tillsats av 1 ml sterilt MilliQ-vatten och centrifugering vid högsta hastighet (14 800 g, 1 min). Supernatanten avlägsnades och ytterligare 0,25 ml sterilt MilliQ-vatten tillsattes. Det återstående celextraktet maldes slätt med sterila Assistent®-glaspärlor (Ø 2 mm, Glaswarenfabrik Karl Hecht, Tyskland) i en skakapparat (6 °C, 30 minuter) och alla prover användes sedan i en RAPD-reaktion (random amplification of polymorphic DNA) för att studera förekomsten av L. plantarum 299v. Mastermix för 35 prover med 175 μL buffert (Qiagen, Tyskland), 35 μL dNTP (Roche Diagnostics, Tyskland), 35 μL primer 73 (Qiagen, Tyskland) och 8,75 μL Taq-polymeras (Qiagen, Tyskland) framställdes. 7,25 μL av mastermixen tillsattes till varje PCR-rör (Gene Amp 0,5 mL, Applied Biosystems, Singapore) tillsammans med 42,75 μL H2O och 1 μL av supernatanten från proverna.
RAPD-reaktionen utfördes i en PCR-maskin (Perkin Elmer, DNA Thermal Cycler, USA) i enlighet med Quednau et al. Geler för gelelektrofores framställdes genom att 0,75 g Agarose DNA Grade Electran® (VWR, Belgien) tillsattes i 50 mL TB-buffert; lösningen värmdes sedan tills den kokade och hälldes i gelbehållare för att svalna. Gelerna sattes slutligen i gelbrickor med TB-buffert. 2-5 μl av varje prov tillsattes i varje brunn tillsammans med 3 μl laddningsbuffert innan elektroforesen kördes (100 V, 1 timme). Gel Redx3 (Biotium Inc., USA), 1 mL i 99 mL dH2O, användes i 20 minuter för att färga gelerna och foton togs enligt Quednau et al. .
2.8. Statistiska beräkningar
Data utvärderades statistiskt med hjälp av en Kruskal-Wallis envägsvariansanalys (ANOVA) på rangord eller ett Mann-Whitney rangordssummetest när så var lämpligt. Ett -test användes för parvis jämförelse av de absoluta IgA-koncentrationerna samt av de absoluta kortisolnivåerna. De statistiska verktygen var Sigma Plot (11.0 och 12.0) och Excel 2013. Dessutom utfördes ett incidensstest avseende förekomsten av L. plantarum 299v med Fisher Exact-test med hjälp av QuickStat (2.6). Data presenterades som median och interkvartilområde samt medelvärde och standardavvikelse. Minimi- och maximivärdena för kortisolproverna ströks för att ta bort effekten av outliers, eftersom en tydlig avvikelse kunde ses i data. Detta gällde endast kortisolproverna. Värden som tillhörde deltagare som inte uppfyllde alla studiens krav kontrollerades och visade sig inte avvika. Deras resultat inkluderades därför.
2.9. Etiskt tillstånd
Studien godkändes av den regionala etikprövningsnämnden i Lund (Ref 2013/166) och de etiska övervägandena omfattade fördelarna och riskerna med den använda produkten och möjligheten till redan existerande personliga relationer mellan den ansvariga testpersonalen och de försökspersoner som utförde studien.
3. Resultat
3.1. Utvärdering av den psykologiska bedömningen
Den psykologiska bedömningen visade ingen signifikant skillnad i upplevd stress mellan grupperna, och det fanns dessutom ingen signifikant skillnad inom varje grupp när man jämförde de olika provtagningsdagarna.
3.2. Kortisolnivåer i saliv
De absoluta kortisolnivåerna (nM) på referensdagen (dag 0) var 9,18 (±2,50) för placebogruppen och 9,47 (±2,96) för testgruppen, utan någon signifikant skillnad mellan de två grupperna (). När den relativa förändringen av mediankortisolnivåerna jämfördes med ett referensvärde på dag 0 (baslinjen), fann man en signifikant skillnad mellan grupperna på dag 10 (; figur 1). Ingen signifikans hittades inom grupperna.
3.3. IgA-koncentrationer i saliv
De absoluta IgA-nivåerna (mg/100 ml) i saliven från den mindre körteln på referensdagen (dag 0) var 1,99 (±3,76) för placebogruppen och 4,80 (±9,17) för testgruppen, utan någon signifikant skillnad mellan de två grupperna (). De absoluta IgA-nivåerna (% IgA/totalt protein) i hela saliven vid referensdagen (dag 0) var 25,3 (±7,37) för placebogruppen och 27,1 (±12,2) för testgruppen, utan någon signifikant skillnad mellan de två grupperna (). I motsats till de förändrade kortisolnivåerna påverkades inte mediankoncentrationerna av IgA i saliven i hel saliv eller saliv från de mindre körtlarna av probiotikakonsumtionen; det vill säga, ingen signifikant skillnad visades mellan probiotikagruppen och placebogruppen (figurerna 2 och 3, resp.).
3.4. Livskraftigt antal laktobaciller och identifiering av L. plantarum 299v
Dag 14 fanns det en signifikant ökning av mängden laktobaciller i saliven hos de försökspersoner som konsumerade probiotika i jämförelse med dem som fick placeboprodukten (). Ökningen var också signifikant () inom probiotikagruppen när man jämförde baslinjen med den sista provtagningsdagen (, figur 4). Förekomsten av isolat som identifierades som L. plantarum 299v var signifikant ökad dag 14 hos personer med detekterbara nivåer av laktobaciller, både jämfört med placebogruppen och med utgångsvärdet ().
4. Diskussion
De flesta deltagarna hade sin tentamen före studiens slut, vilket resulterade i en uppenbar, men inte signifikant (), topp av upplevd stress på dag 10 för placebogruppen. Detta sammanfaller med toppen i salivkortisolkoncentrationen i placebogruppen på dag 10 (figur 1). Däremot sågs ingen topp i probiotikagruppen, vilket tyder på att probiotikakonsumtionen hade en effekt på stress som ses som utsöndring av kortisol från binjurarna. På dag 14 hade många av de frivilliga avslutat sina tentor och en minskning av kortisol kunde därför förväntas, eftersom kortisol reagerar relativt snabbt på akuta stressorer.
Akademisk stress, här i form av en tentamensperiod, kan inte betraktas som kronisk stress, eftersom deltagarna kan se ett slut på den stressiga perioden. Det föreslås därför att akademisk stress mer liknar akut stress när det gäller stressreaktionen. Kortisolnivåerna i den aktuella studien låg i samma intervall som vad som tidigare har rapporterats för akut stress .
Kronisk stress är relaterad till en ihållande ökad utsöndring av kortisol. Det har nyligen diskuterats om det är de faktiska ökade nivåerna av kortisol eller snarare hur målvävnaderna reagerar på de ökade nivåerna som är orsaken till många sjukdomar och symtom i samband med kronisk stress . Det man vet är att en långvarig ökning av blodglukosnivåerna kan leda till muskelförlust, fettansamling och omfördelning samt eventuellt diabetes. Ett möjligt mål för probiotika skulle därför kunna vara kroniskt stressade individer, där de ihållande förhöjda kortisolnivåerna ökar risken för att utveckla sjukdomar kopplade till kronisk stress .
Det finns generellt sett stora individuella skillnader i de uppmätta nivåerna av IgA i saliven, vilket försvårar försöken att se skillnader mellan små grupper av individer. Medianvärdena i de olika grupperna motsvarar dock väl de värden som rapporterats av andra . De föreliggande resultaten från hela salivproverna visade att värdena mellan placebo- och testgruppen inte skiljde sig signifikant från varandra och att medianvärdena i de båda grupperna var likartade. Om man tittar på den relativa förändringen i varje grupp var medianvärdet något positivt för probiotikagruppen, medan det var något negativt i placebogruppen. Om man jämför med 25:e och 75:e percentilerna observeras en ökning av en stor del av de upptäckta IgA-nivåerna i saliven i placebogruppen, vilket gör det svårt att dra några slutsatser (figur 2). Stressorer som orsakar kronisk stress har kopplats till minskade nivåer av saliv-IgA , medan akut stress har visat sig öka nivåerna , vilket tyder på en aktivering av immunsvaret. Man skulle därför kunna föreslå att stressorn i den här studien är mer trolig att vara akut än kronisk.
Förra studier har visat en trend som tyder på att probiotika kan öka IgA-nivåerna i spottkörteln under stress . Testpersonerna i den aktuella studien hade dock endast ett intag av probiotika under en tvåveckorsperiod, och även om det fanns en signifikant högre nivå av laktobaciller i denna grupp kan det möjligen vara så att studieperioden var för kort för att se tydliga förändringar på individnivå. På grund av de stora individuella skillnaderna i IgA-nivåerna i saliven hade det också varit önskvärt med ett ökat antal deltagare i varje grupp.
Den saliviga IgA-nivån i saliven från den lilla körteln visar sig vara högre än vad som rapporterats av andra, vilket kan bero på individuella skillnader eller på grund av studiedesignen i detta arbete. Till exempel tillämpades en viss stressnivå och stresstyp på deltagarna, vilket inte tillämpades i studien gjord av Sonesson et al. . Uppgifterna från saliven från minor gland saliv visade att medianvärdena var högre i testgruppen än i placebogruppen, men skillnaden mellan grupperna var inte signifikant. Ökningen verkar vara större i den grupp som fick probiotika jämfört med placebogruppen, men den relativa förändringen av medianvärdet är ungefär lika stor i de två grupperna. Felstaplarna visar dock på stora variationer inom gruppen som fått probiotika, vilket kan förklara motsägelsen (figur 3).
Kort naturalistisk stress, inklusive akademisk stress, förväntas ligga någonstans mellan akut och kronisk stress när det gäller ökning eller minskning av stressmarkörer. Eftersom stressorn är svår att definiera när det gäller vilken typ av stress som tillämpas och eftersom den individuella stress som tillämpas på varje deltagare kan ha varit olika, är de obetydliga skillnader som hittades i linje med teorin för hur IgA kan återspegla stress. Det hade kanske varit lättare att observera förändringar i IgA i saliven om studieperioden hade varit längre, eller om ytterligare prover hade samlats in en eller två veckor efter studien, eftersom IgA-nivåerna har setts minska även en tid efter den upplevda stressen i andra studier . En annan förklaring kan vara att även om deltagarna uppmanades att skriva ner eventuella förändringar i sitt hälsotillstånd (t.ex. förkylningsincidenter), kontrollerades detta varken för eller jämfördes med avvikande värden i saliv-IgA-data. Förkylningar och andra luftvägsinfektioner skulle förmodligen orsaka en ökning av IgA i saliven, eftersom IgA är en del av immunsystemets första försvarslinje mot patogener.
Det fanns en signifikant ökning av nivåerna av laktobaciller för probiotikagruppen, även i jämförelse med placebogruppen, vilket visar att de administrerade bakterierna kunde överleva i munhålan (figur 4). Detta stöddes också av resultatet av RAPD-typningen, som visade på förekomsten av L. plantarum 299v i de prover där nivåerna av laktobaciller låg över detektionsgränsen. Det verkar alltså finnas ett samband mellan ökad närvaro av probiotiska bakterier och minskade kortisolnivåer i saliv.
5. Slutsatser
Det finns en signifikant skillnad i kortisolutsöndringssvaret mellan testpersoner som fått probiotika eller placebo, möjligen i samband med stress. En signifikant ökning sågs dessutom i nivåerna av laktobaciller för probiotikagruppen i jämförelse med placebogruppen. Däremot sågs ingen signifikans för IgA i saliven.
Competing Interests
Irini Lazou Ahrén är anställd på Probi AB. Produkten och placebokapslarna tillhandahölls av Probi AB. Inga andra konkurrerande intressen ska rapporteras.
Författarnas bidrag
De två första författarna, Hannah Andersson och Cecilia Tullberg, har bidragit lika mycket till denna artikel och det första författarskapet är delat.
Acknowledgments
Författarna tackar Jie Xu och Marie Kala, Lunds universitet, för hjälp i laboratoriet.