Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cinnamaldehyde

Selektion av enzymer för biosyntesen av cinnamaldehyd

Cinnamaldehyd kan syntetiseras från l-p-fenylalanin och biosyntesen kräver tre enzymatiska reaktioner: (i) deaminering av L-fenylalanin till cinnaminsyra genom fenylalaninammoniaklyas (PAL, EC 4.3.1.24), (ii) syra-thiol-ligering av cinnaminsyra till cinnamoyl-CoA genom 4-kumarat:CoA-ligas (4CL, EC 6.3.1.24), (iii) enzymer för att framställa cinnamoyl-dehyddehyd.2.1.12) och iii) reduktion av cinnamoyl-CoA till cinnamaldehyd genom cinnamoyl-CoA-reduktas (CCR, EC 1.2.1.44) (fig. 1a). PAL är ett allestädes närvarande enzym som finns i många växter, svampar och vissa bakterier, och det har olika aktiviteter och specificiteter beroende på enzymets ursprung . Vi undersökte två PAL-enzymer, ett från växten Arabidopsis thaliana (AtPAL) och ett från bakterien Streptomyces maritimus (SmPAL), med avseende på deras lämplighet för att producera cinnamsyra i E. coli. När det gäller AtPAL finns det fyra isomerer, däribland AtPAL1 till AtPAL4, och det har tidigare rapporterats att de flesta av dem (AtPAL1, 2 och 4) har liknande högre aktivitet än AtPAL3 för l-phenylalanin som substrat, så vi valde AtPAL1 som en representant från växtkällan. Deras kinetiska konstanter (Km) rapporterades vara 68 respektive 23 μM . Varje His-märkt PAL-enzym producerades i E. coli BL21(DE3) och renades enligt de förfaranden som beskrivs i ”Metoder”. Båda enzymerna, AtPAL1 (78 kDa) och SmPAL (56 kDa), renades framgångsrikt (Additional file 1: Figur S1). Även om uttrycksnivån för AtPAL1 inte var så hög att bandet inte kunde ses i filerna 1 och 2 i SDS-PAGE, kunde bandet av AtPAL1 tydligt ses efter affinitetskolonnkromatografi i fil 3 där den koncentrerade eluten laddades. Motsvarande molaritet av varje renat PAL-enzym inkuberades med samma mängd l-phenylalanin (som substrat), och produktionstitern av cinnamsyra kvantifierades med högpresterande vätskekromatografi (HPLC) (Additional file 2: Figur S2). Som framgår av fig. 1b uppvisade SmPAL betydligt högre aktivitet (21 gånger vid 30 °C reaktion och 27 gånger vid 37 °C reaktion) än AtPAL1.

Vi undersökte också två olika 4CL-enzymer, ett från Streptomyces coelicolor (ScCCL) och ett annat från A. thaliana (At4CL), med avseende på deras lämplighet att omvandla cinnaminsyra till cinnamaldehyd i E. coli. När det gäller At4CL är det känt att det finns 14 förmodade isoformer (At4CL1-At4CL14). Bland de 14 isoformerna har At4CL1-3 liknande aktiviteter för cinnamat, medan resten av isoformerna inte har det. Därför valde vi At4CL1 som representativ. Vi använde också CCR-enzym från A. thaliana (AtCCR1) för omvandling av cinnamoyl-CoA till cinnamaldehyd . Varje 4CL-enzym (At4CL1 och ScCCL ) testades i kombination med CCR-enzym från A. thaliana (AtCCR). Alla enzymer renades framgångsrikt med hög renhet (Additional file 1: Figur S1). För att jämföra de enzymatiska aktiviteterna hos At4CL1 och ScCCL framställdes två reaktioner, i) At4CL1 med AtCCR och ii) ScCCL med AtCCR, och blandades med cinnamsyra som substrat. Efter inkubation vid 30 och 37 °C analyserades cinnamaldehydtitern med HPLC. Som framgår av figur 1c resulterade kombinationen av ScCCL och AtCCR i en högre produktionstiter av cinnamaldehyd (4,4 gånger vid 30 °C reaktion och 10,4 gånger vid 37 °C reaktion) än kombinationen av At4CL1 och AtCCR. Baserat på dessa resultat konstruerade vi ett biosyntessystem för cinnamaldehyd i E. coli enligt beskrivningen nedan med hjälp av följande enzymer: SmPAL, ScCCL och AtCCR.

Konstruktion av biosyntesvägen för cinnamaldehyd i E. coli

För att producera cinnamaldehyd i E. coli klonades generna SmPAL, ScCCL och AtCCR in i pTrc99A i följande ordning: SmPAL, ScCCL och AtCCR (vilket ger pHB-CAD) (fig. 2a). E. coli W3110 med pHB-CAD odlades vid två olika temperaturer (30 och 37 °C) för att hitta den optimala temperaturen för produktion av cinnamaldehyd. Enzymernas uttryck analyserades med SDS-PAGE, följt av western blot-analys enligt beskrivningen i ”Metoder”. Vid båda temperaturerna uttrycktes alla enzymer väl och var mycket lösliga (fig. 2b). Även om varje enzym uttrycktes på olika nivå var uttrycket av varje enzym marginellt bättre vid 37 °C än vid 30 °C. En analys av den cinnamaldehydtiter som producerades i odlingsmediet med hjälp av HPLC visade också att cinnamaldehydproduktionstitern var 4,5 gånger högre vid 37 °C än vid 30 °C (fig. 2c). Vi antog att den högre produktionstitern av cinnamaldehyd vid 37 °C berodde på en ökad uttrycksnivå för alla biosyntetiska enzymer vid 37 °C, även om dessa enzymer är aktiva vid 30 °C . Nedan utfördes alla odlingar för produktion av cinnamaldehyd vid 37 °C.

Stammanpassning för att öka den intracellulära poolen av l-p-fenylalanin

För biosyntesen av cinnamaldehyd krävs l-p-fenylalanin som en viktig prekursor . För att öka produktionen av cinnamaldehyd är det därför önskvärt att öka den intracellulära poolen av l-phenylalanin. För detta ändamål har vi rationellt omkonstruerat E. coli för att producera mer l-phenylalanin. Med hjälp av tillgänglig metabolisk och regulatorisk information som vägledning konstruerade vi E. coli W3110 på följande sätt: (i) Deletion av crr-genen som kodar för EIIAGlc-protein relaterat till det glukosspecifika fosfenolpyruvatfosfotransferas-systemet (PTS) för att moderera substratupptagshastigheten, minska metabolitöverflödet och prekursorberikningen, (ii) Deletion av tyrR-genen för att lindra den snäva regleringen av TyrR-regulatorn som innehåller gener för syntesen av aromatiska aminosyror (AAA), (iii) borttagning av generna trpE (anthranilatsyntaskomponent) och tyrA för att förhindra förlust av kolflödet till konkurrerande vägar (biosyntes av l-tryptofan och l-tyrosin), och (iv) borttagning av genen pykA (pyruvatkinas A) för att berika prekursorn och balansera flödet mellan tillväxt och produktion av l-fenylalanin (fig. 3). Baserat på ovanstående schema utvecklades fem sekventiella knockout-mutanter av E. coli W3110 (YHP01-YHP05) (tabell 1).

För det första inaktiverades ett glukosspecifikt fosfenolpyruvat PTS genom deletion av crr-genen i E. coli W3110-stammen, vilket gav E. coli YHP01. Även om detta stör huvudsystemet för glukosinternalisering kan YHP01 fortfarande växa i definierade medier som innehåller glukos som enda kolkälla eftersom det mannosespecifika PTS och galaktospermeaset kan fortsätta att internalisera glukos i cytoplasman . Att kringgå PTS resulterar i en ökad pool av fosfenolpyruvat (PEP), vilket i slutändan underlättar l-phenylalaninsyntesen . Därefter raderade vi tyrR-genen i YHP01 för att få fram YHP02-stammen. TyrR-proteinet är en regulator i TyrR-regulatorn, som innehåller åtta gener som är involverade i biosyntesen av AAA . Dess strykning kan också öka l-phenylalaninpoolen genom att lindra den snäva regleringen av gener som är relaterade till AAA-syntesen. Därefter raderade vi successivt trpE- och tyrA-gener med början i YHP02-stammen, vilket gav YHP03- respektive YHP04-stammar. I biosyntesvägen för AAA-ämnen sker en sista förgrening där chorismat kan omvandlas till l-fenylalanin, l-tryptofan eller l-tyrosin av PheA-, TrpE- eller TyrA-enzymerna. Deletioner av trpE- och tyrA-gener kan förhindra att kol går förlorat till konkurrerande vägar för biosyntesen av l-tryptofan och l-tyrosin. Slutligen raderade vi pykA-genen i YHP04 för att få fram YHP05-stammen. PykA-genen kodar för pyruvatkinas A (PykA), som utgör det andra PEP-konsumerande steget. Genom att ta bort pykA-genen kan mer PEP användas i shikimatvägen och följaktligen kan en större mängd l-phenylalanin produceras. I varje stam (YHP01-YHP05) verifierades borttagningen av generna genom PCR och agarosgelelektrofores (Additional file 3: Figur S3).

Alla konstruerade E. coli-stammar, inklusive YHP01-YHP05 och föräldrastammen E. coli W3110, odlades i skakflaskor som innehöll halvdefinierade medier, och celltillväxt och produktion av L-fenylalanin jämfördes. Efter 48 timmars odling växte alla konstruerade stammar något bättre än W3110-stammen; särskilt E. coli YHP05-stammen uppvisade den högsta celltätheten (fig. 4a). I en tidigare studie observerades också att inaktivering av PTS- och Pyk-isoenzymerna ökade kolflödet till biomassabildning på grund av effekten av att man bevarade minskade mängder intermediära metaboliter till följd av minskat glukosupptag och minskad katabolism . Vi analyserade också produktionstitern av l-phenylalanin i odlingssupernatanten med HPLC. I parentalstammen W3110 var produktionstitern av l-p-fenylalanin 0,24 g/L, men titerna av l-p-fenylalanin ökade gradvis i de konstruerade E. coli-stammarna (fig. 4a). E. coli YHP05, där crr-, tyrR-, trpE-, tyrA- och pykA-gener raderades, uppvisade den högsta produktionstitern för l-p-fenylalanin (0,52 g/L), vilket var 2,2 gånger högre än hos föräldrastammen E. coli W3110. Därför bestämde vi oss för att använda E. coli YHP05-stammen för fortsatt ingenjörskonst.

Plasmidbaserat överexpressionssystem för att öka den intracellulära poolen av l-p-fenylalanin

Med utgångspunkt i E. coli YHP05-stammen förbättrades produktionen av l-p-fenylalanin ytterligare med hjälp av plasmidbaserad genöverkompression. Återkopplingsinhiberingen i l-p-fenylalaninsyntesvägen av shikimat och l-p-fenylalanin minskades genom överuttryckning av isozymer eller införande av mutationer i enzymer som är involverade i shikimatvägen enligt följande: (i) överuttryck av genen för 3-deoxy-d-arabinoheptulosonat 7-fosfat (DAHP) syntas som kodas i aroG med teknik (AroG8/15), (ii) överuttryck av ydiB- och aroK-gener som kodar för shikimatdehydrogenas och shikimatkinas för att öka kolflödet till shikimatbanan, (iii) överuttryck av pheA-genen som kodar för CHA-mutas/prefenatdehydratas med ingenjörskonstruktion för att förbättra substratbindningsaffiniteten (PheAfbr, dm), och iv) överuttryck av generna galP (galaktospermeas) och glk (glukokinas) för att underlätta glukosupptaget (Additional file 4: Figur S4).

För att lindra återkopplingshämningen konstruerades plasmidet pTac15kG, som innehöll den konstruerade aroG8/15-genen. AroG är det viktigaste enzymet som deltar i syntesen av DAHP, men AroG hämmas fullständigt av l-phenylalanin (så lågt som 0,1 mM) . Det är känt att införandet av två mutationer (D146N och A202T) resulterade i resistens mot återkopplingshämning utan att påverka dess höga specifika aktivitet (AroG8/15) , så vi överuttryckte detta muterade AroG8/15-enzym. Därefter konstruerades två plasmider (pTac15kGB och pTac15kGBK) för att överuttrycka ydiB- och aroK-generna tillsammans med aroG8/15-genen, respektive. Metaboliskt flöde till shikimatvägen kan ökas när shikimatdehydrogenas (YdiB) och shikimatkinas (AroK) överuttrycks . Plasmidet pTac15kGBKA konstruerades också senare för att överuttrycka pheA-genen som kodar för chorismatmutas/prefenatdehydratas med mutationer. I denna konstruktion amplifierade vi endast de första 300 aminosyrorna i PheA av vildtyp (PheAfbr), vilket utesluter den regulatoriska domänen; därför påverkas PheAfbr svagt av återkopplingshämning. Eftersom PheAfbr dessutom har ett högre Km-värde än PheA av vildtyp, vilket återspeglar dess minskade bindningsaffinitet till substratet , införde vi två mutationer (E159A och E232A) i PheAfbr för att öka dess substratbindningsaffinitet, vilket ger PheAfbr, dm . Slutligen konstruerades pYHP-plasmid för att överextrycka galP- och glk-generna ytterligare, som kodar för galaktospermeas respektive glukokinas. Båda enzymerna underlättar glukosupptag .

Efter konstruktion av fem plasmider, inklusive pTac15kG, pTac15kGB, pTac15kGBK, pTac15kGBKA, pTac15kGBKA och pYHP (tabell 1), transformerades varje plasmid till E. coli YHP05. Efter odling i 48 timmar i skakflaskor med halvdefinierade medier analyserades celltillväxten och produktionstitern av l-phenylalanin. Alla celler växte väl, och särskilt E. coli YHP05 med pYHP växte till en marginellt högre celltäthet (OD600 = 9,76) än de andra (fig. 4b). Vi analyserade också produktionstitern av l-phenylalanin i kultursupernatanten med HPLC. Övexpression av aroG8/15-genen (pTac15kG) resulterade i en signifikant ökning av produktionen av l-phenylalanin (2,25 g/L) jämfört med YHP05 som inte bär på någon plasmid (0,52 g/L) (fig. 4b). Efterföljande överexpression av andra gener resulterade i en seriell ökning av produktionstitern av L-fenylalanin och E. coli YHP05 med pYHP uppvisade den högsta produktionstitern av L-fenylalanin (3,91 g/L) (fig. 4b). Effekten av pYHP-plasmidet resulterade i en signifikant ökning av produktionen av l-p-fenylalanin så hög som 16,4-faldigt respektive 7,5-faldigt. Vid odling av E. coli YHP05 med pYHP var avkastningen av l-p-fenylalanin på glukos och produktiviteten 0,270 g/g respektive 0,082 g/L/h (Additional file 5: Figur S5). I den konstruerade E. coli YHP05 med pYHP förbättrades alltså poolen av l-phenylalanin avsevärt. Liu et al. har tidigare rapporterat att produktionen av L-fenylalanin i E. coli var så hög som 47 g/L . Detta rekord kunde dock uppnås i matad batchodling (15 L skala) och de använde sig av samexpression av transportören för l-p-fenylalanin (YddG) för en effektiv produktion av l-p-fenylalanin i odlingsmediet. I vårt arbete introducerade vi inte YddG eftersom det slutliga målet med vårt arbete inte var produktion av l-phenylalanin utan produktion av cinnamaldehyd. Även om den titer av l-phenylalanin som uppnåddes i vårt arbete inte var rekordhög, ansåg vi att den var tillräckligt hög för produktion av cinnamaldehyd. Därför bestämde vi oss för att använda denna konstruerade stam för produktion av cinnamaldehyd.

Cinnamaldehydproduktion i den konstruerade E. coli

Med hjälp av den konstruerade E. coli YHP05 som bär på pYHP undersökte vi först produktionen av cinnamsyra. För detta experiment konstruerades plasmid pHB-CA, som innehåller SmPAL-genen under IPTG-inducerbar trc-promotor (tabell 1). E. coli YHP05 med både pHB-CA och pYHP odlades i kolvar i 48 timmar och produktionstitern av cinnamsyra analyserades. E. coli YHP05 och E. coli W3110 med pHB-CA (utan pYHP) undersöktes också som kontroller. Tillväxtmönstren för alla celler var likartade (fig. 5a) och E. coli W3110 och YHP05 med pHB-CA producerade 79 respektive 108 mg/L cinnamsyra (fig. 5b). E. coli YHP05 med både pHB-CA och pYHP uppvisade en betydligt bättre produktionstiter (287 mg/L), som var 3,6 gånger och 2,7 gånger högre än för E. coli W3110 och YHP05 med pHB-CA (fig. 5b). Såvitt vi vet var denna produktionstiter också 1,5 gånger högre än den högsta nivån (186 mg/L) som rapporterats för E. coli . Detta resultat visar tydligt att den ökade mängden l-phenylalanin i den konstruerade E. coli-stammen bidrar positivt till att öka produktionen av cinnaminsyra.

Som ett huvudmål undersökte vi kanelamaldehydproduktionen i den konstruerade E. coli YHP05-stammen, som transformerades med pHB-CAD och pYHP. Dessutom undersöktes E. coli YHP05 och E. coli W3110 med pHB-CAD (utan pYHP) som kontroller. Celltillväxten var likartad (fig. 6a), och de tre biosyntetiska enzymerna för cinnamaldehyd var väl uttryckta i alla undersökta celler (Additional file 6: figur S6). Efter kolvodling i 48 timmar samlades odlingssupernatanterna upp och produktionstitrarna av cinnamaldehyd bestämdes med HPLC. E. coli W3110 (pHB-CAD) och E. coli YHP05 (pHB-CAD) uppvisade kanelamaldehydproduktionstiter som var så höga som 2,18 respektive 6,3 mg/L (fig. 6b). E. coli YHP05 (pHB-CAD och pYHP) uppvisade däremot en betydligt högre produktionstiter (75 mg/L), som var 35 gånger högre än E. coli W3110 (pHB-CAD).

Nematicidal aktivitet av cinnamaldehyd producerad av konstruerad E. coli

För att utvärdera den nematicida aktiviteten av cinnamaldehyd producerad i odlingsmedium behandlades nematoderna, B. xylophilus, med cinnamaldehyd enligt de förfaranden som beskrivs i ”Metoder” . Odlingssupernatanten från E. coli YHP05 med pYHP och pHB-CAD späddes ut tills slutkoncentrationen av kanelamaldehyd var 60 mg/L, och nematoderna behandlades med den utspädda odlingssupernatanten. Efter 1 och 4 timmar överlevde endast 26 % respektive mindre än 18 % av nematoderna (fig. 7). Som en positiv kontroll behandlades nematoderna med kommersiellt tillgänglig och renad cinnamaldehyd i motsvarande koncentration (60 mg/L). Efter 4 timmar var nästan alla nematoder (95 %) dödade. Dessa resultat visade att den nematicida aktiviteten var likartad mellan kommersiellt köpt kanelamaldehyd och producerad kanelamaldehyd i den här studien. Som en negativ kontroll testades också kultursupernatanten av E. coli W3110 och som förväntat överlevde nästan alla nematoder (>92 %) efter 4 h.