GFP
Grönt fluorescerande protein (GFP) är en polypeptidgenprodukt med 238 aminosyror som upptäcktes i maneten Aequorea victoria. Proteinet har en naturlig grön fluorescens under specifika ljusförhållanden. Proteinet får sin bioluminescens från Ser-Tyr-Gly-cyklisering i sin primära aminosyrasekvens. GFP är ganska stabilt och tål ett antal kemiska behandlingar och förfaranden.1 Den första demonstrationen av att detta fluorescerande protein kunde uttryckas i ett heterologt system var i C. elegans.2 GFP har sedan dess blivit en populär reportergen eftersom den inte kräver någon biokemisk omvandling, kontrastmedel eller användning av skadlig joniserande strålning för att kunna visualiseras.3 Sedan den första rapporten har GFP-reportergenuttryck rapporterats i flera organismer, inklusive möss.4 Dessutom kan transgena GFP-möss, under ledning av en specifik promotor, uttrycka det fluorescerande proteinet på ett vävnads- och till och med cellspecifikt sätt. Den icke-invasiva visualiseringen är nyckeln till att kunna övervaka fysiologiska och biokemiska processer in vivo och i realtid.5
Det finns många sätt att visualisera GFP:s bioluminiscens. Ett sätt att upptäcka fluorescensen är med ett handhållet UV-ljus (365 nM). Det finns flera modeller som erbjuds av Fisher i en prisklass på cirka 100 till 200 dollar. Den handhållna UV-ljusmetoden fungerar inte särskilt bra för den transgena stammen GFPX (Stock 003116). Dr. Andras Nagy, donator av GFPX- och GFPU-transgener (Stock 003115 och 003116), beskriver ett headset för betraktare och ett filter som kan anpassas till mikroskop och som nu finns tillgängliga i handeln.
CFP och YFP
Nyligen gjorda framsteg har förbättrat egenskaperna och användbarheten av GFP som reportergen. Förbättrad GFP (EGFP) har konstruerats så att den uttrycks i högre nivåer i däggdjursceller och fluorescerar mer intensivt. Cyan Fluorescent Protein (CFP) och Yellow Fluorescent Protein (YFP) är spektrala varianter av GFP som gör det möjligt att märka flera celltyper samtidigt.
Cubitt AB, Heim R, Adams SR, Boyd AE, Gross LA, Tsien RY. 1995. Förståelse, förbättring och användning av gröna fluorescerande proteiner. Trends Biochem Sci 20:448-55.
Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC. 1994. Grön fluorescerande protein som en markör för genuttryck. Science 263:802-5.
Hoffman RM. 2002. Grön fluorescerande protein som avbildar tumörceller i möss. Lab Animal 31(4): 34-41.
Okabe M, Ikawa M, Kominami K, Nakanishi T, Nishimune Y. 1997. ”Gröna möss” som en källa till allestädes närvarande gröna celler. FEBS Lett 407:313-9.
Yang M, Baranov E, Jiang P, Sun FX, Li XM, Li L, Hasegawa S, Bouvet M, Al-Tuwaijri M, Chishima T, Shimada H, Moossa AR, Penman S, Hoffman RM. 2000. Optisk helkroppsavbildning av tumörer och metastaser som uttrycker grönt fluorescerande protein. Proc Natl Acad Sci USA 97:1206-11.
lacZ
Användningen av en reportergen kan göra det möjligt att undersöka rumsliga mönster för genuttryck av en viss promotor i en vävnad, ett embryo eller en vuxen mus.1 E. coli lacZ-genen kan, när den integreras i musens arvsmassa med hjälp av transgena tekniker, användas som en reportergen som styrs av en viss promotor/förstärkare i en transgenuttryckskassett. LacZ-genen kodar för beta-galaktosidas, som katalyserar klyvningen av laktos till galaktos och glukos. Betagalaktosidasaktivitet kan identifieras med både in situ- och in vitro-tekniker när den inkuberas med betagalaktosidas-substratet X-gal. Betagalaktosidas klyver X-gal, ett kromogent substrat, vilket resulterar i ett olösligt blått färgämne, vilket gör det möjligt att identifiera celler med lacZ-aktivitet.2 Transgena djur kan sedan användas för att identifiera faktorer och förhållanden som modulerar promotorns eller enhancerns uttrycksprofil.