Integrerad syntes av nukleotider och nukleosider som påverkas av aminosyror

Simultan bildning av glykosyleringsprodukter

Bildningen av nukleosid- och nukleotidstrukturer från enkla prekursorer uppnåddes samtidigt med tre nukleobaser genom dehydreringsreaktioner. Detta står i kontrast till tidigare arbete på detta område, där förhållandena optimerades för att gynna specifika produkter24,25,26. I ett typiskt glykosyleringsexperiment värmdes adenin och P-ribos vid 90 °C i 5 timmar vid pH 2,5. Vi observerade bildandet av adeninmonofosfat (AMP)-nukleotid (och dess isomerer) när adenin och P-ribose kombinerades. De extraherade jonkromatogrammen (EIC) som erhållits från HPLC-MS-analysen av produkterna visade flera toppar med m/z-matchning + och + (kompletterande figurer 13-15). Jämförelse med standarder bekräftade att AMP motsvarar den topp som hittades vid RT = 4,2 min (kompletterande figurer 5 och 6); andra större toppar kan överensstämma med AMP-isomerer, t.ex. den N6-ribosylerade isomeren. För att bekräfta detta utfördes en hydrolysereaktion i närvaro av NaOH (0,1 M) i ett försök att skilja mellan de olika isomererna, med tanke på att den N6-ribosylerade isomeren är mer mottaglig för hydrolys. En liten störning i topparna kan dock observeras, vilket gör det svårt att bekräfta identiteten hos den N6-ribosylerade isomeren. Vi analyserade sedan två rena standarder av två olika isomerer (adenosin 3′-monofosfat och adenosin 5′-monofosfatmonohydrat) individuellt och i en blandning för att belysa isomerernas elueringsprofil (kompletterande figurer 148 och 149). En förskjutning av retentionstiden kan observeras för standardblandningen, vilket ger en bättre korrelation med elutionen av dessa föreningar i det verkliga provet. Även om det är svårt att skilja mellan isomerer kan vi bekräfta förekomsten av minst två isomerer i AMP-produkterna genom att jämföra elueringsprofilen för standardblandningen med det verkliga provet. Det står nu klart att bildandet av olika isomerer (kompletterande figur 12) är en möjlig orsak till att nukleotider med samma massa elueras vid olika retentionstider. Dessutom visar MS/MS-analysen av våra reaktionsprodukter att AMP (och dess isomerer) fragmenteras till adenin (m/z = 136,0617 ± 0,01) (kompletterande figur 20); detta stämmer överens med fragmenteringen av den kanoniska AMP-standarden. Vår föreslagna reaktionsmekanism består av bildandet av en glykosidbindning mellan en 1′-OH-grupp i ribos och en aminogrupp i adenin (se kompletterande figur 12).

Tidsförloppsreaktioner visar att vattenavdunstning är den huvudsakliga drivkraften för bildandet av glykosyleringsprodukter, vilket visar på en signifikant ökning av bildandet av nukleosid- och nukleotidstrukturer under tidsperioden mellan 2 och 4 timmar (fig. 2a). Detta motsvarar det tidsintervall då provvolymen minskar drastiskt och reagenserna är extremt koncentrerade. Efter 5-6 timmars reaktion når provet torrhet och reaktionshastigheten (följt av intensiteten i HPLC-MS-mätningar) stabiliseras. Förutom AMP har produkter som innehåller glykosidiska bindningar, inklusive cykliska nukleotider (dvs. cAMP)27 och nukleosider (dvs. adenosin), detekterats med hjälp av RP-HPLC-MS, MS/MS och testats med avseende på bildning av 1,N6-ethenoderivat28,29 , vilket bekräftats genom jämförelse med standarder (fig. 2, kompletterande figurer 7-11, kompletterande figurer 23-27). Retentionstiderna för de kanoniska standarderna 2′,3′-cAMP och 3′,5′-cAMP motsvarade inte retentionstiderna för EIC-topparna i provet. Massfördelningarna (+; +) och fragmenteringsmönstren (+) var dock identiska (kompletterande figurer 16-21). Dessa resultat visar att även om cykliska strukturer bildas är kanoniskt cAMP inte huvudprodukten. En jämförelse med en analytisk standard för adenosin visar också att adenosin, tillsammans med ett antal isomeriska arter, bildas i kondensationsreaktionen mellan P-ribose och adenin (kompletterande figurer 18-22). Även om de kanoniska formerna av AMP och adenosin bekräftades i dessa experiment var de inte huvudprodukterna i dehydreringsreaktionen.

När fosfat tillfördes separat som pyrofosfat och reagerade med adenin och ribose, detekterades en förening med massan adenosin och en låg mängd AMP och cAMP, och adenosin bildades fortfarande när ingen fosfatkälla fanns närvarande (kompletterande figurer 33-41). Det är värt att notera att vi avsiktligt har fokuserat våra studier på att identifiera fosforylerade produkter (AMP-isomerer och cAMP-isomerer) och ägnat mindre uppmärksamhet åt att identifiera fosforylerade produkter som inte är AMP-isomerer och cAMP-isomerer30,31,32. Vi föreslår att det bildas en glykosidisk bindning mellan hydroxylgruppen i ribose och en aminogrupp i adenin, vilket utlöses av förlusten av en vattenmolekyl genom avdunstning. Den relativa reaktiviteten hos de primära och sekundära amingrupperna i adenin är väl studerad33 och utan aktivering eller närvaro av en skyddsgrupp är glykosidisk bindning vid den primära aminen normalt att föredra. Den kanoniska isomeren av adenosin/AMP förväntas därför inte vara en viktig produkt, eftersom den skulle kräva reaktion uteslutande vid den sekundära aminen. Reaktiviteten är dock tillräckligt hög vid den sekundära aminen för att de kanoniska isomererna ska kunna bildas, om än inte som huvudprodukt. I andra nukleobaser, t.ex. guanin, finns det ännu fler tillgängliga amingrupper och potentialen för isomera produkter är större. Reaktiviteten hos ribose är sannolikt främst genom den anomeriska positionen, vilket leder till färre möjliga isomerer, även om några andra mindre produkter kan observeras.

Reaktiviteten hos andra kanoniska nukleobaser (cytosin, guanin och tymin) med P-ribose undersöktes också. Massor som motsvarar nukleosid- och nukleotidstrukturer upptäcktes efter dehydreringsreaktionen av guanin och cytosin med P-ribose (fig. 3 och kompletterande figurer 50-64). Guanin-glykosyleringsstrukturer bildades i relativt liten utsträckning, sannolikt på grund av guanins begränsade löslighet vid lågt pH. De produktmängder som uppmättes för 5-metyluridinmonofosfat (m5UMP) och 5-metyluridin (tymin-nukleosid) var till och med lägre än deras motsvarigheter från guanin och cytosin (figur 3 och kompletterande figurer 65, 66). Dessa resultat kan förklaras av förekomsten av en primär aminogrupp i guanin och cytosin, som saknas i tymin. Även om alla tre nukleobaser har sekundära aminogrupper är dessa mindre reaktiva vid bildandet av glykosidiska bindningar. Därför är bildandet av nukleosid- och nukleotidstrukturer genom en sekundär aminreaktion, vilket krävs för att bilda kanoniska glykosyleringsprodukter, missgynnat i nukleobaser där primära aminer finns tillgängliga. Detta har en intressant implikation för antagandet av nukleinsyrakemi vid livets uppkomst, eftersom det tyder på att de kanoniska nukleotiderna till en början kan ha varit olämpliga tills ytterligare biokemiska maskiner hade uppstått för att öka selektiviteten mot de korrekta isomererna. Som förväntat bildades kanoniska nukleotid- och nukleosidprodukter av cytosin och guanin i våra experiment, men de motsvarade inte de huvudsakliga topparna som observerades (kompletterande figurer 42-49). Genom att kombinera dessa två observationer (olika retentionstider men samma massfördelning som kanoniska standarder i EIC:erna) kan vi dra slutsatsen att de nukleotid- och nukleosidarter som bildades från dehydreringsreaktionen av guanin/cytosin med P-ribose huvudsakligen var isomeriska arter av de kanoniska nukleotiderna och nukleosiderna (några möjliga strukturer visas i de kompletterande figurerna. 50, 51).

Typiskt sett har bildandet av nukleotidstrukturer utförts under specifika förhållanden beroende på vilket nukleobas som använts, med inriktning på en specifik reaktionsprodukt. I ett alternativt tillvägagångssätt beslutade vi att inkludera flera nukleobaser samtidigt i reaktionen med P-ribose. Vårt mål var att fastställa om produktbildningen med flera nukleobaser under samma reaktionsförhållanden skulle ge en blandning av produkter eller domineras av en. Denna reaktion genomfördes genom att två eller tre nukleobaser (adenin, guanin och cytosin) samtidigt inkluderades i reaktionskärlet tillsammans med P-ribose. En blandning av glykosyleringsprodukter erhölls, bestående av nukleotider (AMP, GMP och CMP) samt respektive cykliska nukleotid- (cAMP, cGMP och cCMP) och nukleosidprodukter (adenosin, guanosin och cytidin) (kompletterande figurer 67-95). Guanin-glykosyleringsprodukter bildades med lägre utbyte än adenin och cytosin, vilket förväntades på grund av guanins låga löslighet under sura förhållanden.

Nukleobasutbyte

Nukleobasutbyte observerades när Na+AMP värmdes under 5 h vid 90 °C i sura vattenhaltiga medier med cytosin eller guanin. Nukleobasutbytet resulterade i bildandet av nukleotid- (CMP eller GMP), cyklisk nukleotid- (cCMP eller cGMP) och nukleosidstrukturer (cytidin eller guanosin) (se kompletterande figurer 96-102 och kompletterande tabell 1 för semikvantitativa utbyten). I detta experiment visade CMP och cytidin en ökande trend i intensitet, medan cCMP nådde en maximal intensitet när den var 12,5 mM och sedan sjönk till en intensitet på 4,0 × 104 AU (kompletterande figurer 102a och 155-158). Vid en cytosinkoncentration på 37,5 mM visade sig den förening med högre intensitet vara CMP och de uppmätta intensiteterna för cCMP och cytidin var nästan desamma. Två huvudsakliga isomeriska arter observerades i EIC för CMP och cCMP. Massorna +, + och + upptäcktes för CMP, medan cCMP uppvisade +, + och + inom sina respektive massfördelningar. När det gäller cytidin var + den viktigaste upptäckta toppen. Dessa massfördelningar överensstämde med de som observerades i standarderna. Retentionstiden för de viktigaste isomererna motsvarade dock inte den kanoniska CMP och cytidin. När AMP reagerade med ökande koncentrationer av guanin (kompletterande figur 102b) nådde alla tre glykosyleringsprodukterna (GMP, cGMP och guanosin) ett maximalt värde när koncentrationen av guanin var 2,5 mM (kompletterande figurer 160-162). Dessa resultat var en följd av den begränsade guaninlösligheten vid surt pH, så även om mer guanin tillsattes till reaktionskärlet var den effektiva koncentrationen i lösningen densamma. Efter det maximala värdet var intensiteten av cGMP och guanosin konstant på grund av guanins dåliga löslighet. Endast en liten ökning av intensiteten för alla tre guaninglykosyleringsprodukterna observerades när = 37,5 mM, vilket kan relateras till en större förekomst av guanin i lösningen på grund av den höga koncentrationen som tillsattes. I EIC för GMP observerades ett brett område utan väldefinierade toppar, även om två huvudtoppar stack ut. + var den enda kemiska art som var relaterad till guaninföreningar och som upptäcktes i massfördelningen i dess EIC. Fyra toppar, grupperade i par, observerades när cGMP:s EIC extraherades från MS-data och massfördelningen visade + och + arter. Å andra sidan visade EIC för guanosin tre toppar, varav den mest intensiva visade förekomsten av + i dess massfördelning.

Bildningen av glykosyleringsprodukter av cytosin och guanin visade att klyvning av AMP-glykosidbindningen inträffade under våra reaktionsförhållanden. När EIC för AMP, cAMP och adenosin analyserades observerades flera toppar i varje kromatogram, vilket stöder teorin att glykosidbindningar genomgår dynamisk hydrolys/bildning under dehydreringsreaktionen34. Reaktionerna mellan cytosin- och guaninnukleotider och adenin undersöktes också. När det gäller dehydreringsreaktionen mellan CMP och adenin kunde inga produkter som motsvarar nukleobasutbyte observeras (kompletterande figurer 103-108/a). Adeninglykosyleringsprodukter upptäcktes dock tydligt vid reaktionen mellan GMP och adenin (kompletterande figurer 105-108/b). Detta beror på att hydrolysen av glykosidbindningar i GMP är lättare än för CMP under samma reaktionsförhållanden34. Vi har också utfört nukleobasutbytesreaktionen med UMP och adenin för att jämföra med den direkta pyrimidinanalogen av adenin (kompletterande figur 109). Resultaten liknade mer CMP-avkastningen som visas i Supplementary Fig. 108, än GMP-avkastningen, vilket ger en mycket låg avkastning för adeninglykosyleringsprodukterna i UMP-reaktionen som inte är tillräcklig för att möjliggöra detektion av AMP och cAMP.

Aminosyrornas effekt på glykosyleringsprodukternas fördelning

Som tidigare nämnts kan aminosyror, nukleotider och deras byggstenar ha funnits på den tidiga jorden vid samma tidpunkt. Därför kan produkter från en sampolymeriseringsreaktion, eller till och med produkter som är resultatet av någon katalytisk effekt av en typ av polymer framför den andra, ha uppstått i en prebiotisk miljö. För att studera samreaktiviteten hos nukleotidbyggstenar och aminosyror i en dehydrering i en enda kruka inkluderades glycin, den enklaste aminosyran, i dehydreringsreaktionerna av P-ribose och respektive nukleobaser. Införandet av glycin hade en tydlig effekt på bildandet av glykosyleringsprodukter, vilket ledde till att det totala utbytet av produkter med massan av AMP-isomerer, cAMP-isomerer och adenosin (fig. 4a och kompletterande fig. 28-32) minskade. Detta tyder på att glycin spelar en roll genom att antingen förbruka nukleotidbyggstenar (P-ribose och/eller adenin) genom en sidoreaktion, eller att det blir bundet till produktstrukturen och ändrar dess massa. EIC-analysen för dessa reaktioner avslöjar toppar som motsvarar massan av glycinaddukter (dvs. AMP-Gly, cAMP-Gly, adenosin-Gly och adenin-Gly) (kompletterande figurer 115-122), även om dessa sidoprodukter inte bildas i tillräcklig mängd för att förklara alla observerade förändringar. Glycinaddukterna bekräftades också genom att använda deutererat glycin som utgångsmaterial tillsammans med P-ribose och adenin, vilket orsakade förändringar i den isotopiska fördelningen av adduktmassorna (kompletterande figurer 123 och 124). Ett maximalt semikvantitativt utbyte på 59 % erhölls för bildandet av glykosyleringsprodukter (AMP-isomerer, cykliska AMP-isomerer och adenosin) vid reaktionen av P-ribose och adenin; dock erhölls endast 46 % utbyte när glycin också förekom i reaktionsmediet (kompletterande fig. 144). Det är tekniskt svårt att kvantifiera utbytet för alla möjliga enskilda isomerer, men halvkvantitativa utbyten för vissa isomerer kunde bestämmas med hjälp av rena standarder: Adenosin 5′-monofosfat och adenosin 2′,3′-cykliskt monofosfat hittades till 38,7 % respektive 18,2 % i frånvaro av glycin, medan utbytet i närvaro av glycin visade sig vara betydligt lägre (<2 %) för båda isomererna.

Glycin påverkade också fördelningen av isomera arter, och tydliga skillnader observerades i jämförelse med baspikskromatogrammet (BPC) från reaktionen av P-ribose och adenin, i närvaro och avsaknad av glycin (Fig. 4b och Supplementary Figs. 110-114). Dessa data tyder på förekomsten av olika kemiska arter och en därav följande förändring i massfördelningen mellan reaktionerna med och utan glycin. Individuella EIC analyserades sedan för varje adeninglykosyleringsprodukt, vilket resulterade i att tydliga skillnader observerades i topparnas relativa intensitet när glycin tillsattes. Dessa resultat visar tydligt att glycin har en selektiv effekt på vilka isomeriska arter som företrädesvis bildas. Det är känt att glycin reagerar lätt med andra aminer under dehydrerande förhållanden12 , och det är troligt att det reagerar med de primära aminerna i nukleobaser. Hybridsidprodukter som innehåller glycin (Gly-AMP, Gly-cAMP, Gly-Adenosin, Gly-Adenin) upptäcktes i ~1 % utbyte (kompletterande figur 145), men denna lilla procentandel har en viktig effekt på den isomera fördelningen av adeninglykosyleringsprodukterna (se kompletterande figurer 146 och 147). Förändring i isotopfördelningen av massorna hos hybridprodukterna upptäcktes (kompletterande figurer 123, 124) när deuterat glycin ingick i dehydreringsreaktionen, vilket bekräftar att glycin ingår i hybridstrukturerna.

En liknande effekt på isomerfördelningen observerades också när P-ribose reagerade med cytosin/guanin i närvaro av glycin (figur 4c, kompletterande figurer 125-140). De maximala intensiteterna för de olika isomerarterna minskade (GMP, CMP, cGMP, cCMP, guanosin och cytidin), medan fördelningen av de relativa intensiteterna också påverkades. Skillnaderna mellan experimenten verifierades noggrant med hjälp av en statistisk metod som klusteranalys av EIC-data för att segmentera proverna, i närvaro och frånvaro av glycin, i grupper/kluster med gemensamma egenskaper (fig. 5). Syftet med klusteranalysen i den här studien är att gruppera data (dvs. bildandet av nukleotid- och nukleosidstrukturer) i konstituerande sammansättningar med gemensamma egenskaper (t.ex. tillsats av glycin jämfört med avsaknad av glycin). Denna analys bör visa på hög intern homogenitet inom kluster/grupper och hög extern heterogenitet mellan kluster/grupper. I figur 5 visas ett dendrogram med ”Wards”-länkning35. För att identifiera kluster i dendrogrammet har vi färgat spektren beroende på förekomsten av glycin (glycin – rött, inget glycin – svart, tomt – blått). Som man kan se, grupperar sig glycinhaltiga prover tillsammans. Ett kluster motsvarar P-ribose + adenin + glycin (tre prover), som skiljs från prover utan glycin. Ett andra kluster motsvarar P-ribose + guanin + glycin och P-ribose + cytosin + glycin. Prover som innehåller adenin separeras till ett större kluster som skiljer sig från de andra proverna, vilket tyder på ett starkt inflytande av adenin i reaktionen. Det finns faktiskt ett antal andra möjliga produkter och reaktioner som kan äga rum under de genomförda reaktionsförhållandena (se kompletterande anmärkning 1 och kompletterande figurer 150-162 för mer information).

Andra aminosyror inkluderades också i dehydreringsreaktionen av adenin med P-ribose för att testa om de också skulle ha en viss effekt på den isomera fördelningen av glykosyleringsprodukterna (Supplementary Figs. 141-143). De sex aminosyror som valts ut för denna studie (arginin, glutaminsyra, treonin, metionin, fenylalanin och tryptofan) har olika sidokedjor med olika kemisk natur och funktionella grupper. När resultaten jämfördes med de data som erhållits från reaktionen av endast P-ribose och adenin observerades förändringar i den isomera fördelningen av AMP i alla reaktioner, utom när det gäller tryptofan, vilket kan tillskrivas konformationsbegränsningar på grund av närvaron av tryptofans indolbaserade sidokedja. Vid analys av cAMP EIC noterades mindre förändringar i den relativa intensiteten hos de isomeriska topparna. En tydlig skillnad observerades dock i adenosins EIC endast för de reaktioner som inkluderade fenylalanin och threonin.