En av de viktigaste metoderna inom virologi är att mäta virustitern – koncentrationen av virus i ett prov. Ett allmänt använt tillvägagångssätt för att bestämma mängden infektiöst virus är plackanalysen. Denna teknik utvecklades först för att beräkna titrarna hos bakteriofagbestånd. Renato Dulbecco modifierade detta förfarande 1952 för användning inom djurvirologi, och det har sedan dess använts för tillförlitlig bestämning av titrar av många olika virus.
För att utföra en plackanalys förbereds 10-faldiga utspädningar av en virusstock, och 0,1 ml alikvot inokuleras på mottagliga cellmonolager. Efter en inkubationstid, för att viruset ska kunna fästa på cellerna, täcks monolagerna med ett näringsmedium som innehåller ett ämne, vanligen agar, som orsakar bildandet av en gel. När plattorna inkuberas släpper de ursprungliga infekterade cellerna ut virusavkomma. Spridningen av de nya virusen begränsas till angränsande celler av gelen. Följaktligen ger varje infektiös partikel upphov till en cirkulär zon av infekterade celler som kallas plack. Så småningom blir placket tillräckligt stort för att vara synligt för blotta ögat. Färgämnen som färgar levande celler används ofta för att öka kontrasten mellan de levande cellerna och placken. Endast virus som orsakar synliga skador på celler kan undersökas på detta sätt. Ett exempel på plack som bildats av poliovirus på ett monolager av HeLa-celler visas till vänster. I denna bild har cellerna färgats med kristallviolett och plackerna är lätt synliga där cellerna har förstörts av virusinfektion.
Titern för ett virusbestånd kan beräknas i plackbildande enheter (PFU) per milliliter. För att bestämma virustitern räknas plackerna. För att minimera felet räknas endast plattor som innehåller mellan 10 och 100 plack, beroende på storleken på den cellodlingsplatta som används. Statistiska principer säger att när 100 plack räknas kommer provets titer att variera med plus eller minus 10 %. Varje utspädning pläteras i två exemplar för att öka noggrannheten. I exemplet nedan finns det 17 plack på plattan från utspädningen 10-6. Virusstockens titer är därför 1,7 x 108 PFU/ml.
Nästan ska vi se på hur plackanalysen kan användas för att förbereda klonala virusstockar, ett steg som är viktigt för att studera virusgenetik.
Dulbecco, R., & Vogt, M. (1953). Vissa problem inom djurvirologin som studeras med plaktekniken. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 18, 273-279