DISCUSSION
Citrobacter är en viktig orsak till opportunistiska infektioner; C. diversus är förknippad med cirka 40 % av de fall som presenteras, medan C. freundiire står för cirka 29 % (11). Citrobacterspp. orsakar neonatal meningit och har en ovanlig benägenhet att orsaka hjärnabscess (8, 14). Patogenesen för Citrobacter spp. som orsakar meningit och hjärnabscess är inte väl karakteriserad, men precis som för andra meningit-bakterier måste det ske en penetration av blod-hjärnbarriären. Denna studie genomfördes för att bättre förstå de potentiella interaktionerna mellanCitrobacter och blod-hjärnbarriären. C. freundii valdes som modellbakterie för dessa studier eftersom bakteriens genetik är bättre definierad och ett genomiskt bibliotek finns tillgängligt för eventuella studier om den molekylära grunden förCitrobacter-invasion och replikation i HBMEC. Experiment som utfördes med ett cerebrospinalvätskeisolat av C. diversus gav liknande resultat (data visas inte), vilket tyder på att frekvensen och mekanismen för HBMEC-invasion för dessa två arter kan vara likartad.
Blod-hjärnbarriären är en komplex struktur som består av plexus plexus choroidus-epitelet och hjärnans kapillära endotel. Förekomsten av täta korsningar och låg pinocytotisk aktivitet för endotelcellerna resulterar i en begränsning av makroelement som passerar genom blod-hjärnbarriären. För närvarande vet man inte var i blod-hjärnbarriären C. freundii tränger in, men man fann att plexus choroidus sällan var involverad i spädbarnsråttmodellen av experimentell hematogen Citrobacter-meningit (16). Dessutom täcker endotelmikrovaskulära celler den största ytan av blod-hjärnbarriären, och andra meningit-bakterier som orsakar meningit har visat sig invadera mikrovaskulära endotelceller in vitro (13, 20, 25). Vi valde därför HBMEC för vår studie. Vävnadskulturinvasionsanalyser och TEM-studier gav bevis för att C. freundii invaderar HBMEC. Resultaten från invasionsanalyser som utfördes i närvaro av olika eukaryotiska cellhämmare tyder på att C. freundiis invasion i HBMEC är en mikrofilament-, mikrotubuli-, de novo-proteinsyntes- och endosomförsurningsberoende process. Utökade invasionsförsök fastställde att C. freundii kan överleva och replikera intracellulärt under långa perioder in vitro. TEM-analyser visade att enskilda och flera C. freundii-celler är intracellulärt lokaliserade i vakuolliknande strukturer med ett enda membran. Transwell-experiment visade att C. freundii kan passera genom ett polariserat monolager av HBMEC, medan E. coli inte kan göra det. Dessutom visar våra preliminära uppgifter att C. freundii penetrerar blod-hjärnbarriären i den neonatala råttmodellen för experimentell hematogen meningit (21). Sammantaget tyder dessa resultat på att C. freundii invaderar vakuoler, möjligen replikerar, transcytoserar genom HBMEC, släpps ut på den basolaterala sidan och penetrerar på så sätt blod-hjärnbarriären.
Invasion av eukaryota celler av C. freundii har rapporterats (22, 35). Detta är dock den första rapporten om invasion av HBMEC av C. freundii. Märkligt nog är de eukaryotiska kraven för C. freundiis invasion lika olika som de celltyper som C. freundii har visat sig invadera. Den clathrinbelagda pit-hämmaren MDC har t.ex. visat sig hämma C. freundiis invasion i alla andra celltyper som undersökts (t.ex. humana kärl-, tarm- och blåsepitelceller) utom, som visats i den här studien, i HBMEC. Dessutom tar sig andra meningitis-orsakande bakterier som hittills karakteriserats in i HBMEC på en eller flera vägar som är beroende av mikrotubuli och som är MDC-känsliga (20, 24, 27). Hämmarna MDC och ouabain som hämmar klatrinbelagda gropar har inte visat sig hämma alla receptorer; det kan alltså vara så att den receptor som är nödvändig för C. freundiis invasion av HBMEC inte påverkas av hämmaren MDC eller ouabain. Även om de bevis som hittills samlats in tyder på att C. freundiis inträde i HBMEC kanske inte sker genom en MDC- eller oabain-känslig receptormedierad väg, verkar det som om både endosomförsurning och de novo-proteinsyntes krävs. De tillgängliga uppgifterna tyder på två möjliga scenarier. Endosomförsurning kan behövas som en miljöutlösande faktor för intracellulär bakterieöverlevnad. Liknande krav har karakteriserats för Salmonellas epitelinvasion (26). Alternativt kan endosomförsurning och proteinsyntes krävas för separation av ligand-receptorkomplexet, syntes av receptorn och/eller presentation av receptorn på HBMEC-ytan för att C. freundii skall kunna invadera. Det senare scenariot påminner om andra invasiva patogener, där kontakt med den livskraftiga organismen krävs för att modulera eukaryota celladhesionmolekyler som är nödvändiga för invasionen (t.ex. Streptococcus pneumoniae och receptorn för trombocytaktiverande faktor) (2). Experiment pågår i vårt laboratorium för att skilja mellan dessa föreslagna scenarier.
Invasionstest utförda i närvaro av mikrotubulihämmare (både depolymeriserande och stabiliserande medel) minskade signifikant HBMEC:s förmåga att ta upp C. freundii. Konfokalmikroskopiexperiment med anti-α-tubulin-antikroppar visade att mikrotubuli aggregeras efter att HBMEC kommit i kontakt med C. freundii. Aggregationen av mikrotubuli var en tidsberoende process; ingen aggregering sågs efter 5 minuter, lite efter 15 minuter och tydlig aggregering observerades efter 30 minuters inkubation av C. freundii med HBMEC. Denna mikrotubuliaggregation hämmades när cellerna behandlades med antingen mikrotubulihämmare eller mikrofilamenthämmande medel. Intressant är att färgningsmönstret för mikrotubuliaggregation inte samlokaliserades med bakteriebindning och att områden av HBMEC som inte uppvisade C. freundii-bindning också uppvisade en uttalad mikrotubuliklumpning. Detta tyder på att bakteriernas kontakt med HBMEC globalt kan stimulera aggregering av mikrotubuli. Det återstår att se om mikrotubuliaggregationen är ett resultat av en utsöndrad bakteriefaktor eller ett parakrint svar på bakteriernas bindning till HBMEC. Dessutom kan aggregeringen av mikrotubuli som svar på C. freundii-bindning vara relaterad till den postulerade receptorpresentationen via de novo-proteinsyntes och endosomförsurning. Det har tidigare visats att transporten av många receptorer till och från cellytan är beroende av mikrotubuli (10). En förklaring till den hämmande effekten av mikrotubulihämmare på C. freundiis inträde i HBMEC är därför att medlen kan minska antalet HBMEC-receptorer som förmedlar C. freundiis invasion. Experiment pågår för att skilja mellan dessa möjligheter.
Mikrotubuli har tidigare visat sig vara nödvändiga för invasion av många patogener (t.ex. Neiserria gonorrheae, Haemophilus influenzae, enteropatogena och enterohemorragiska E. coli och Campylobacter jejuni (4, 9, 22, 23, 29). Den allmänna uppfattningen har varit att även om dessa patogener kan ta sig in genom mikrotubuliberoende vägar, replikerar de vanligtvis inte intracellulärt (6). De data som förvärvats i den här studien från utökade invasionsförsök och TEM-analys tyder på attC. freundii kan vara ett undantag från denna generalisering. I motsats till vad som har beskrivits för en annan intravakuole-replikerande bakterie, Legionella pneumophila(12), förekom inga mitokondrier eller ribosomer i nära anslutning till bakterierna. Detta tyder på att C. freundii kanske inte använder dessa organeller för att direkt få energi eller att rekrytering av specifika värdcellsproteiner kanske inte krävs för intracellulär överlevnad och proliferation (som i fallet med L. pneumophila). Av särskild relevans för infektioner i centrala nervsystemet har andra meningitis-orsakande bakterier som E. coli K1, GBS och S. pneumoniae på liknande sätt visat sig invadera (1, 13, 25) eller invadera och transcytosera (20, 27) BMEC; organismerna har dock inte visat sig replikera i HBMEC. Som beskrivits ovan har Citrobacter-meningit dokumenterats för sin höga frekvens av hjärnabscessbildning. Huruvida replikation inom HBMEC-vakuoler är unikt för Citrobacter och om det finns ett samband med abscessbildning återstår att fastställa.
Cytokalasin D hämmar C. freundiis invasion i HBMEC; med hjälp av immunfärgning fann vi dock ingen påvisbar omorganisering av mikrofilamenten när C. freundii interagerade med HBMEC (data visas inte). Dessutom hämmade cytokalsin D-förbehandling av HBMEC den bakterieberoende mikrotubuliaggregationen som visualiserades med konfokalmikroskopi. Det kan finnas flera förklaringar till dessa resultat. Cytochalsin D:s effekt på den bakterieberoende mikrotubuliaggregationen kan bero på indirekta effekter av mikrofilamenthämmaren på mikrotubulnätverket. Mikrotubuli har till exempel observerats fungera som förankringsstrukturer för F-actin (28). Därför kan en störning av mikrofilamentnätverket påverka mikrotubulnätverket och därmed indirekt påverka den mikrotubulberoende C. freundii-invasionen av HBMEC. Alternativt kan ett aktinberoende invasionssteg föregå ett mikrotubuliberoende steg i C. freundiis invasion av HBMEC. Detta första steg kan resultera i en omorganisering av mikrofilamenten när bakterierna först kommer i kontakt med HBMEC; dessa händelser kan dock vara övergående och den experimentella utformningen med immunofluorescensmikroskopi kan inte på ett adekvat sätt upptäcka deras förekomst. En liknande situation noteras för Yersiniainvasin-medierad invasion (36). Om de inledande faserna av invasionen förhindras av cytokalasin D utlöses därför inte de efterföljande faserna av invasionen, som är mikrotubuliberoende. Det har tidigare visats att aktin fungerar vid translokationen av aktinbindande proteinfaktorer till plasmamembranet samt vid cytosolisk signalering (19). Dessutom hämmar cytokalasin D Salmonellas inträde via störning av translokationen av aktinbindande proteiner till bakteriens inträdesplats (7). Det är möjligt att när det gäller C. freundiis invasion av HBMEC är aktinmikrofilamenten nödvändiga för cytosolisk signalering och/eller bakteriepenetration vid plasmamembranet, och mikrotubuli kan vara nödvändiga för transport av membranbundna bakterier från plasmamembranet mot den basolaterala sidan (eller bara djupare in i cellen). Således skulle ett avbrott i något av invasionsstadierna resultera i en ”trafikstockning”.
Sammanfattningsvis tyder de resultat som presenteras här på att C. freundii kan invadera, föröka sig i och transcytosera HBMEC in vitro. Att fastställa den genetiska grunden för dessa fenotyper kommer att ge betydande insikter i patofysiologin för Citrobactermeningitis och potentiellt bidra till att utveckla nya terapeutiska och förebyggande strategier. Dessutom kan en omfattande molekylär jämförande analys av Citrobacter med andra hjärnhinneinflammationsframkallande bakterier kasta ljus överCitrobacters unika egenskap att bilda abscesser i hjärnan.