Back to Basics – What is an Immunoassay – Downloadable PDF Version
What is an immunoassay or ELISA?
Immunoassays är snabba och exakta tester som kan användas på plats och i laboratoriet för att påvisa specifika molekyler. Immunoassays bygger på en antikropps inneboende förmåga att binda till den specifika strukturen hos en molekyl. Antikroppar är proteiner som djur genererar som svar på att en främmande molekyl (antigen) tränger in i kroppen. Antikroppar finns i blod och vävnadsvätska och binder till antigenet närhelst det påträffas. Eftersom antikroppar är utvecklade för den specifika tredimensionella strukturen hos en antigen, eller analyten, är de mycket specifika och binder endast till den strukturen. När de har renats från blodet är monoklonala och polyklonala antikroppar idealiska testreagenser för att detektera och övervaka specifika målmolekyler med begränsade störningar från andra ämnen. Fyra typiska ELISA-format är: sandwich-immunoassay för antikroppar, antigen-down-immunoassay, kompetitiva inhiberingsanalyser och snabbanalyser.
Sandwich-immunoassay för antikroppar
I en typisk sandwich-immunoassay för antikroppar adsorberas en monoklonal antikropp på en mikrotiterplatta av plast. När testprovet tillsätts till plattan kommer antikroppen på plattan att binda målantigenet från provet och hålla kvar det i plattan. När en polyklonal antikropp tillsätts i nästa steg binder den också till målantigenet (som redan är bundet till den monoklonala antikroppen på plattan) och bildar på så sätt en antigen-”sandwich” mellan de två olika antikropparna.
– Steg 1: Monoklonala antikroppar adsorberas på brunnen i en mikrotiterplatta av plast med beläggningsbuffert (inget prov tillsatt).
– Steg 2: Ett prov (t.ex. människoblod, lämpligt utspätt) tillsätts i mikrotiterplattans brunn. Målantigenet binder till den antikropp som adsorberats på plattan, vilket håller kvar antigenet i brunnen.
– Steg 3: Bindning av en enzymkonjugerad polyklonal antikropp till målantigenet (som är bundet till den monoklonala antikroppen på plattan), varvid det bildas en antigen-”sandwich” mellan de två olika antikropparna.
– Steg 4: Tillsats av ett kolorimetriskt substrat för detektion av de enzymkonjugerade polyklonala antikropparna kommer att generera en färgsignal som är proportionell mot mängden målantigen som finns i det ursprungliga provet som tillsatts till plattan.
Antigen-Down (Immunity Test) Immunoassay
I en antigen-down (immunitetstest) immunoassay är analyten belagd som används för att binda antikroppar som finns i ett prov. När provet tillsätts (t.ex. humant serum) binds antigenet på plattan av antikroppar (t.ex. IgE) från provet, som sedan hålls kvar i brunnen. Därefter tillsätts en artspecifik antikropp (t.ex. IgE mot människa) märkt med HRP, som binder till den antikropp som är bunden till antigenet på plattan. Ju högre signal desto fler antikroppar finns det i provet. Antigen-down-analyser (immunitetstest) kan konfigureras som snabbtest och används ofta för att diagnostisera allergiska tillstånd – rutinmässigt testas patientens blod mot olika allergener för att se om personen har antikroppar mot det allergenet.
Kompetitiv inhiberingsimmunoassay
Förutom det monoklonala-polyklonala (Mo-Po) antikroppssandwich-formatet är många immunoassays strukturerade i ett kompetitivt inhibitionsformat. Kompetitiva hämmningsanalyser används ofta för att mäta små analyter eftersom kompetitiva hämmningsanalyser endast kräver bindning av en antikropp i stället för två, som i standard ELISA-format. På grund av den höga sannolikheten för steriska hinder när två antikroppar försöker binda till en liten molekyl samtidigt, är det inte alltid möjligt att använda en sandwichanalys. I en sekventiell kompetitiv inhiberingsanalys tillsätts provet och den konjugerade analyten i steg som i en sandwichanalys, medan dessa reagenser i en klassisk kompetitiv inhiberingsanalys inkuberas tillsammans vid samma tidpunkt. I ett sekventiellt kompetitivt inhibitionsanalysformat beläggs en monoklonal antikropp på en mikrotiterplatta med 96 brunnar. När provet tillsätts fångar MoAb:n upp den fria analyten från provet. I nästa steg tillsätts en känd mängd analyt märkt med antingen biotin eller HRP. Den märkta analyten kommer då också att försöka binda till MoAb som adsorberats på plattan, men den märkta analyten hindras från att binda till MoAb av närvaron av tidigare bunden analyt från provet. Detta innebär att den märkta analyten inte kommer att bindas av den monoklonala substansen på plattan om den monoklonala substansen redan har bundit den omärkta analyten från provet. Mängden omärkt analyt i provet är omvänt proportionell mot den signal som genereras av den märkta analyten. Ju lägre signalen är, desto mer omärkt analyt finns det i provet. En standardkurva kan konstrueras med hjälp av serieutspädningar av en omärkt analytstandard. Efterföljande provvärden kan sedan avläsas från standardkurvan på samma sätt som i sandwich ELISA-format. Den klassiska kompetitiva inhiberingsanalysen kräver samtidig tillsats av märkt (konjugerad analyt) och omärkt analyt (från provet). Både den märkta och den omärkta analyten konkurrerar sedan samtidigt om bindningsstället på den monoklonala fångstantikroppen på plattan. I likhet med det sekventiella kompetitiva inhiberingsformatet är den färgade signalen omvänt proportionell mot koncentrationen av omärkt målanalyt i provet. Detektion av märkt analyt kan göras med hjälp av ett peroxidas-substrat, t.ex. TMB, som kan avläsas på en läsare för mikrotiterplattor.
Snabbt immunoassay
Förutom mikrotiterplattor är immunoassays också konfigurerade som snabbtest, t.ex. ett graviditetstest i hemmet. Liksom mikrotiterplattaanalyser använder snabbtester antikroppar för att reagera med antigener och kan utvecklas som MoAb-PoAb-sandwichformat, kompetitiva hämmningsformat och antigen-down-format. I ett snabbtest är antikropps- och antigenreagenserna bundna till porösa membran, som reagerar med positiva prover samtidigt som överflödiga vätskor leds till en icke-reaktiv del av membranet. Snabba immunoassays finns vanligen i två konfigurationer: ett lateralt flödestestest där provet helt enkelt placeras i en brunn och resultatet avläses omedelbart, och ett flödesgenomströmningssystem som kräver att man placerar provet i en brunn, tvättar brunnen och slutligen tillsätter ett konjugat av analytiskt kolloidalt guld, och resultatet avläses efter några minuter. Ett prov testas per remsa eller kassett. Eftersom snabbtester är snabbare än tester på mikrotiterplattor, kräver lite provhantering, ofta är billigare och ger ja/nej-svar utan att använda ett instrument, används de ofta på fältet av personer som inte arbetar i laboratorier och som testar hela prover. Snabba immunoassays är dock inte lika känsliga och kan inte heller användas för att exakt kvantifiera en analyt (diabetikers egenkontroll av blodglukosnivåerna betraktas som kvantitativa snabbtester, men immunoassayteknik används inte för dessa tester). Alla snabba immunoassay-tester kan omvandlas till en mikrotiterplattaanalys, men inte alla mikrotiterplattaanalyser kan omvandlas till ett snabbtest.
.