Omkring år 1000 f.Kr. bosatte sig en våg av invandrare i den övre Tiberdalen ända till Adriatiska havet, och även i närheten av Assisi. Dessa var Umbrierna, som bodde i små befästa bosättningar på högt belägna platser. Från 450 f.Kr. togs dessa bosättningar gradvis över av etruskerna. Romarna tog kontroll över centrala Italien efter slaget vid Sentinum 295 f.Kr. De byggde det blomstrande municipium Asisium på en rad terrasser på Monte Subasio. Romerska lämningar finns fortfarande kvar i Assisi: stadsmurar, forumet (numera Piazza del Comune), en teater, en amfiteater och Minervas tempel (numera förvandlat till kyrkan Santa Maria sopra Minerva). År 1997 upptäcktes också resterna av en romersk villa som innehöll flera välbevarade rum med fresker och mosaiker i ett skick som sällan återfinns utanför platser som Pompei.
I år 238 e.Kr. konverterades Assisi till kristendomen av biskop Rufino, som blev martyr i Costano. Enligt traditionen vilar hans kvarlevor i katedralkyrkan San Rufino i Assisi.
Kung Totilas östgoter förstörde större delen av staden år 545. Assisi kom sedan under långobardernas styre som en del av det långobardiska och sedan frankiska hertigdömet Spoleto.
Den blomstrande kommunen blev en självständig ghibellinsk kommun på 1000-talet. Den kämpade ständigt mot det guelfiska Perugia och det var under ett av dessa slag, slaget vid Ponte San Giovanni, som Francesco di Bernardone (den helige Franciskus av Assisi) togs till fånga, vilket satte igång de händelser som så småningom ledde till att han levde som tiggare, avsade sig världen och grundade orden av mindre bröder.
Staden, som hade hållit sig inom de romerska murarnas gränser, började expandera utanför dessa murar på 1200-talet. Under denna period stod staden under påvlig jurisdiktion. Rocca Maggiore, den kejserliga fästningen på toppen av kullen ovanför staden, som hade plundrats av folket 1189, återuppbyggdes 1367 på order av den påvlige legaten, kardinal Gil de Albornoz.
I början föll Assisi under Perugias styre och senare under flera despoter, såsom lycksoldaten Biordo Michelotti, Gian Galeazzo Visconti och hans efterträdare Francesco I Sforza, hertigar av Milano, Jacopo Piccinino och Federico II da Montefeltro, herre av Urbino. Staden gick in i en djup nedgång genom den svarta dödens pest 1348.
Staden kom återigen under påvlig jurisdiktion under påven Pius II:s styre (1458-1464).
Under 1569 påbörjades byggandet av basilikan Santa Maria degli Angeli. Under renässansen och under senare århundraden fortsatte staden att utvecklas fredligt, vilket Bernabeis och Giacobettis palazzi från 1600-talet vittnar om.
Nu är Assisi platsen för många pilgrimsfärder och är i legenden förknippad med sin födelseson, den helige Franciskus. Det milda helgonet grundade franciskanerorden och delar ära med Katarina av Siena som Italiens skyddshelgon. Han är ihågkommen av många, även icke-kristna, som en naturälskare (hans predikan inför en publik av fåglar är en av legenderna om hans liv).
Assisi drabbades av två förödande jordbävningar, som skakade Umbrien i september 1997. Men återhämtningen och restaureringen har varit anmärkningsvärd, även om mycket återstår att göra. Massiva skador orsakades på många historiska platser, men den största attraktionen, Basilica di San Francesco, öppnades igen mindre än två år senare.