En uppslamning av harts, t.ex. DEAE-Sephadex, hälls in i kolonnen. Matrisen som används är olöslig med laddade grupper som är kovalent bundna. Dessa laddade grupper kallas utbytare som katjon- och anjonbytare. Efter det att kolonnen har satt sig, pre-equilibreras den i buffert innan proteinblandningen appliceras. DEAE-Sephadex är en positivt laddad uppslamning som kommer att ha elektrostatiska interaktioner med de negativt laddade atomerna, vilket gör att de elueras senare än de positivt laddade molekylerna i det intresserade provet. Detta är en separationsteknik som används ofta för att upptäcka specifika proteiner eller enzymer i kroppen. Obundna proteiner samlas upp i flödet och/eller i efterföljande buffertvättar. Proteiner som binder till det positivt laddade hartset hålls kvar och kan elueras på ett av två sätt. För det första ökas saltkoncentrationen i elutionsbufferten gradvis. De negativa jonerna i saltlösningen (t.ex. Cl-) konkurrerar med proteinet när det gäller att binda till hartset. För det andra kan lösningens pH-värde gradvis sänkas, vilket resulterar i en mer positiv laddning av proteinet och frigör det från hartset. Båda dessa tekniker kan tränga undan det negativt laddade proteinet som sedan elueras i provrörsfraktioner med bufferten.
Separation av proteiner kommer att bero på skillnaderna i total laddning. Sammansättningen av joniserbara sidokedjegrupper kommer att bestämma proteinets totala laddning vid ett visst pH. Vid den isoelektriska punkten (pI) är proteinets totala laddning 0 och det kommer inte att binda till matrisen. Om pH-värdet ligger över pI kommer proteinet att ha en negativ laddning och binda till matrisen i en anjonbyteskolonn. Stabiliteten hos proteinet vid värden över eller under pI avgör om en anjonbyteskolonn eller en katjonbyteskolonn skall användas. Om det är stabilt vid pH-värden under pI-värdet används en katjonbyteskolonn. Om det är stabilt vid pH-värden över pI kan anjonbyteskolonnen användas.