Características de estado excitado do DAPI livre e DAPI ligado ao DNA
O tempo de vida excitado do DAPI é bem conhecido26, por isso medimos o tempo de vida do DAPI não ligado em solução de PBS (pH 7.2) para determinar tanto a sensibilidade do sistema quanto a precisão das medições de vida útil. O decaimento da fluorescência mostrou um duplo caráter exponencial: componentes fluorescentes de vida útil, τ e coeficientes de intensidade, a, são relatados na Tabela 1. O valor do componente de vida longa concorda bem com a literatura, enquanto o valor do componente de vida curta é maior do que o descrito na literatura a pH 7 onde a faixa de valor é 0,19-0,24 ns26.
A seguir medimos a vida útil do DAPI ligado ao DNA contendo diferentes quantidades de bases AT e GC para determinar se a composição da base de DNA tem algum efeito sobre a vida útil do DAPI. Para esta parte do estudo foram usados DNA de timo de bezerro (CT) e micrococcus luteus (ML) devido às suas diferentes composições de pares de bases (42% GC para DNA CT e 72% GC para DNA ML). Foram medidas três soluções cada uma de ADN de CT e ML. A vida útil do DAPI para cada tipo de ADN apresentou dois componentes (Tabela 1). O componente de curta duração do DAPI ligado ao ADN ML é ligeiramente superior ao do ADN CT (diferença de 130 ps). Não há diferença significativa observada entre os componentes de longa duração.
FLIM do DAPI ligado a cromossomos metafásicos fixos de B-Lymphocytes
Figure 1a mostra uma imagem de uma “propagação” típica de cromossomos metafásicos humanos fixados em metanol 3:1:ácido acético (ver Métodos para definição de propagação dos cromossomos). Uma imagem expandida da região fechada na figura tirada com uma resolução maior de pixels é mostrada na Fig. 1b. A cor falsa é usada para representar o valor de vida útil em cada pixel da imagem.
Variações na vida útil do DAPI ao longo da duração dos cromossomas.
Imagens da vida útil de (a) uma propagação dos cromossomas (barra de escala = 10 μm) e (b) uma imagem expandida da região delimitada na Fig. 1a tirada com uma resolução de pixels mais alta mostrando os cromossomas 1 e 9 (barra de escala = 2 μm). Figura 1b inset: curvas de decaimento de fluorescência DAPI normalizadas em pixels selecionados das regiões vermelha, verde e azul no cromossomo 9 na Fig. 1b. A variação da escala de cores ao longo da vida útil vai de 2,50 ns (vermelho) a 3,14 ns (azul), como mostrado.
Algumas figuras mostram que há uma variação na vida útil do DAPI ao longo do comprimento dos cromossomos. As curvas de decaimento da fluorescência DAPI com intensidades normalizadas também são apresentadas na Fig. 1b para complementar as imagens da vida útil e mostrar que a fluorescência das moléculas DAPI nas regiões vermelhas tem um decaimento mais rápido do que a das regiões azuis. A média da vida útil ± desvio padrão (DP) do DAPI para a dispersão cromossômica medida na Fig. 1a foi determinada como sendo de 2,91 ± 0,12 ns; a decadência da fluorescência do DAPI foi determinada como tendo característica exponencial única.
Identificação das regiões heteromórficas nos cromossomos
Doze dispersão cromossômica (células GM18507) com 46 cromossomos cada uma foi medida a partir de três lâminas. A Figura 2a mostra uma imagem vitalícia de uma das distribuições medidas. Em cada uma das lâminas medidas descobrimos que certos cromossomas têm regiões específicas ao longo do seu comprimento que têm tempos de vida significativamente mais curtos do que o resto dos cromossomas, na sua maioria nas proximidades dos centrómeros. Essas regiões aparecem em vermelho nas imagens de vida útil por causa da escala de cores utilizada; devemos nos referir a elas como regiões de vida curta.
Identificação de regiões heteromórficas nos cromossomos.
(a) Imagem de vida útil de um cromossomo espalhado com setas mostrando as regiões heteromórficas (barra de escala = 10 μm). (b) Curvas de distribuição de vida normalizadas para as regiões heteromórficas e o resto dos cromossomas mostrando tempos de vida DAPI mais curtos para as regiões heteromórficas do que para o resto dos cromossomas. (c) Imagem mFISH da distribuição dos cromossomos medidos. (d) Cariotipagem dos cromossomos na Fig. 2a,c com base na cor.
As curvas de distribuição de vida com frequências normalizadas para as regiões de curta vida e o restante dos cromossomos na Fig. 2a são mostradas na Fig. 2b. A média de vida ± DP das moléculas DAPI nas regiões de curta vida na Fig. 2a foi determinada como sendo de 2,48 ± 0,13 ns enquanto que para as moléculas no restante dos cromossomos na dispersão foi determinada como sendo de 2,80 ± 0,09 ns. Os desvios padrão representam quão variados são os valores de vida dentro das regiões de curta vida e o restante dos cromossomos para a dispersão medida.
Suspeitamos que as regiões de curta vida correspondem às regiões heteromórficas nos cromossomos. Tais regiões exibem variações na morfologia em locais específicos, sem afetar o fenótipo e são frequentemente de natureza heterocromática. As variações morfológicas conhecidas das regiões heteromórficas têm sido associadas à longevidade e infertilidade e, portanto, são de grande interesse em estudos genéticos. Sabe-se que regiões heteromórficas ocorrem nos cromossomos 1, 9, 15, 16 e no cromossomo Y27.
Foi decidido realizar experimentos com mFISH (ver Métodos) em todas as distribuições medidas a fim de identificar os cromossomos contendo as regiões de curta duração. A imagem do mFISH e o cariótipo do espalhamento na Fig. 2a são mostrados na Fig. 2c,d, respectivamente. As regiões com menor tempo de vida, em comparação com o restante dos cromossomos, em todos os espalhamentos medidos foram identificadas como sendo as regiões pericentroméricas dos cromossomos 1, 9 e 16, o braço curto do cromossomo 15 e a região distal do cromossomo Y; estas regiões são conhecidas como regiões heteromórficas, confirmando nossa hipótese.
Tabela 2 mostra o valor médio de vida útil do DAPI para cada uma das regiões heteromórficas na Fig. 2a. Como cada autossoma aparece duas vezes, as médias de vida e os desvios padrão para as regiões heteromórficas obtidas para os autossomos com o mesmo número de cromossomos foram calculados e agrupados, respectivamente.
Pode ser observado na tabela que os tempos de vida medidos para as regiões heteromórficas dos cromossomos 1, 16 e Y são semelhantes e são significativamente maiores do que os dos cromossomos 9 e 15. A região heteromórfica do cromossomo 9 pode ser descrita por duas vidas, de modo que a região 9a tem um valor semelhante ao do cromossomo 15, enquanto a região 9b tem uma vida mais curta do que a da região 9a.
As outras distribuições medidas (ver Tabelas S1-S11 nos Materiais Suplementares) mostram uma tendência semelhante das regiões heteromórficas dos cromossomos 9 e 15 terem vidas mais curtas do que as dos cromossomos 1, 16 e Y.
Tendências de vida em DAPI com área cromossômica
Cromossomos são conhecidos por se tornarem progressivamente mais compactos à medida que se aproximam da metafase do ciclo celular; Colcemid foi utilizado para este estudo para bloquear as células nesta fase antes da colheita. Entretanto, não se espera que as células da população sincronizada estejam todas exatamente no mesmo estágio da condensação no momento da colheita. Esta variação na compactação se reflete na variação da área relativa de um cromossomo específico de um cromossomo espalhado para outro na mesma lâmina, com os cromossomos mais compactos tendo áreas menores. Nós antecipamos que diferentes estados de compactação poderiam ter um efeito sobre os tempos de vida fluorescentes observados. Para medir o efeito da compactação dos cromossomos na vida útil, correlacionamos a vida média dos DAPI para vários exemplos de cromossomos do cromossomo 1 (células GM18507) de uma lâmina e suas regiões heteromórficas com a área medida dos cromossomos. Como descrito anteriormente, os valores de vida útil dos pares de cromossomas foram calculados em média, os pixels atribuídos a uma cor de acordo com o valor de vida útil e as regiões de vida curta (regiões vermelhas) foram consideradas como sendo de natureza heteromórfica. A segmentação e análise das regiões heteromórficas e o cálculo das áreas cromossômicas foram realizados utilizando o software Avizo.
O gráfico na Fig. 3 mostra que a vida média do DAPI para o cromossomo 1 e sua região heteromórfica diminui fortemente com a diminuição da área do cromossomo 1. Na medida em que a área de um cromossomo em um espalhamento representa a densidade de embalagem, a tendência observada sugere uma dependência linear da densidade, representando o grau de condensação. Uma tendência semelhante também é observada para a propagação de cromossomos em outra lâmina (ver Figura S1).
Perda de fluorescência média do DAPI para vários cromossomos 1 e suas regiões heteromórficas plotadas contra a área dos cromossomos.
As barras de erro representam o desvio padrão. Assim, o DAPI é sensível tanto à compactação geral do comprimento dos cromossomos quanto à condensação localizada do subcromossomo.
O efeito da concentração DAPI na vida útil
As médias de vida útil do DAPI para vários cromossomos 1 (células GM18507) coradas com diferentes concentrações de DAPI foram medidas para determinar o efeito da concentração DAPI na vida útil. Doze cromossomas 1, com aproximadamente a mesma área, da mesma lâmina foram medidos para cada concentração.
A tabela 3 mostra que a intensidade total do cromossoma 1 aumentou à medida que a concentração de DAPI foi aumentada. Entretanto, não houve variação significativa observada na vida útil do DAPI entre as diferentes concentrações.
FLIM de Hoechst 33258 Limitada a Cromossomos de Metafase Fixa
Para confirmar que as variações ao longo do tempo de vida que observamos ao longo do comprimento dos cromossomos é uma função da estrutura cromatina e não devido a quaisquer efeitos específicos do DAPI, realizamos o FLIM utilizando outro corante de ligação de pequenas ranhuras. Os cromossomos metafásicos (células GM18507) fixados em metanol 3:1:ácido acético foram corados com Hoechst 33258.
Figure 4 mostra a imagem do tempo de vida útil do cromossomo medido espalhado. A deterioração da fluorescência de Hoechst 33258 ligada aos cromossomos foi encontrada com características exponenciais únicas, semelhantes às do DAPI. A vida média ± SD de Hoechst 33258 para a dispersão medida foi determinada em 2,42 ± 0,05 ns. O menor desvio padrão, comparado com o dos cromossomos coloridos por DAPI (0,12 ns), mostra que a variação na vida útil do Hoechst 33258 ao longo da dispersão não é tão alta quanto a observada para os cromossomos coloridos por DAPI. A imagem da vida útil mostra que as regiões heteromórficas dos cromossomas 1, 9, 15, 16 e Y apresentaram valores de vida útil significativamente mais curtos do que o resto dos cromossomas (ver Figura S2 para a imagem mFISH e cariótipo), semelhante ao observado para os cromossomas manchados por DAPI. A vida média ± DP das moléculas de Hoechst 33258 nas regiões heteromórficas foi determinada como sendo de 2,36 ± 0,03 ns enquanto que para as moléculas no resto dos cromossomas na dispersão foi determinada como sendo de 2,43 ± 0,04 ns. Os valores médios de vida útil e desvios padrão para cada uma das regiões heteromórficas dos cromossomos 1, 9, 15, 16 e Y, em comparação com o restante dos cromossomos, são apresentados na Tabela S12.
Imagem em tempo de vida de um cromossomo espalhado corado com Hoechst 33258 com setas mostrando as regiões heteromórficas (barra de escala = 10 μm).
Este experimento adicional usando Hoechst confirma que as variações observadas ao longo da vida dos cromossomos são causadas pela estrutura cromatina local e não pelo fluoróforo utilizado.
FLIM dos Cromossomos DAPI Ligados a Células de HeLa Metáfase Fixa
Medições de FLIM em cromossomos metafásicos manchados com DAPI obtidos de células de HeLa fixadas em metanol 3:1:ácido acético também foram realizadas para verificar que as variações na vida útil do DAPI observadas ao longo do comprimento dos cromossomos não são apenas específicas da linha celular, mas são devidas à estrutura geral dos cromatídeos.
Figure 5a mostra a dispersão cromossômica medida. A vida média ± SD do DAPI para a dispersão medida foi determinada como sendo de 2,93 ± 0,09 ns. A vida mais curta do DAPI, em comparação com o restante dos cromossomos, é observada nas regiões heteromórficas dos cromossomos 1, 9, 15, 16 e Y (ver Figura S3 para a imagem mFISH e cariótipo), semelhante à observada para as células GM18507. Quatro cromossomos anormais consistindo de uma parte dos cromossomos 1 ou 9 também exibiram os menores tempos de vida DAPI em suas regiões pericentroméricas sugerindo que eles contêm a região heteromórfica dos cromossomos 1 ou 9. As curvas de distribuição de vida com frequências normalizadas para as regiões de curta vida e o resto dos cromossomas são mostradas na Fig. 5b. A média de vida das moléculas DAPI nas regiões de curta vida foi determinada em 2,68 ± 0,08 ns enquanto que para as moléculas no restante dos cromossomos na dispersão foi determinada em 2,93 ± 0,08 ns.
Identificação de regiões heteromórficas em cromossomos obtidos de células de HeLa.
(a) Imagem da vida útil de um cromossomo espalhado com setas mostrando as regiões heteromórficas. Os cromossomos encerrados em um quadrado tracejado amarelo são os cromossomos anormais (barra de escala = 10 μm). (b) Curvas de distribuição de vida normalizadas para as regiões heteromórficas e o resto dos cromossomos mostrando tempos de vida mais curtos DAPI para as regiões heteromórficas do que para o resto dos cromossomos.
FLIM do DAPI Ligado a Cromossomos Interfásicos dentro de Núcleos Fixos
A vida útil do DAPI ligado a cromossomos interfásicos dentro de um núcleo fixo 3:1 metanol:ácido acético da linha de células linfocitárias GM18507 também foi imitada, como mostrado na Fig. 6. Uma pilha z do núcleo foi tomada usando um microscópio confocal multifóton (a 760 nm) de excitação multifóton. Fig. 6a,c mostram imagens obtidas em -0,50 μm e +0,50 μm, respectivamente, do plano focal original (Fig. 6b).
Planos focais selecionados a partir da pilha z das imagens do núcleo interfásico das células GM18507 em (a) -0,50 μm, (b) 0 μm e (c) +0,5050 μm foco (barras de escala = 5 μm, veja a Figura S5 para todos os planos focais na pilha z).
Foi observado um único caráter exponencial para a decadência da fluorescência DAPI. As imagens da vida útil do núcleo medido mostram que existe uma forte variação na vida útil do DAPI através do núcleo interfásico, onde regiões localizadas de curta duração podem ser observadas (indicadas por setas na Fig. 6). Mesmo que o núcleo fixo esteja um pouco colapsado em relação à sua forma esférica nativa como resultado do processo de fixação, isto mostra a localização das regiões de curta duração em três dimensões. A reconstrução 3D das imagens confocais em z (ver Figura S4) e a análise quantitativa das regiões de curta duração foram realizadas utilizando o software Avizo.
Tabela 4 mostra o volume, a duração média e a posição em relação ao raio do núcleo das regiões de curta duração. Os volumes calculados para as regiões de curta duração são maiores que o volume típico de um cromossomo metafásico (~1-3 um3), sugerindo uma descompactação considerável da cromatina na interfase. As posições das regiões de curta duração foram calculadas para determinar se elas têm localizações preferenciais no núcleo. Pode ser observado na tabela que as regiões de curta duração estão localizadas mais próximas da periferia do que o centro do núcleo. Examinamos três núcleos neste estudo e constatamos que todos mostraram uma distribuição similar das regiões de curta vida (ver Figuras S6 e S7 para os outros dois núcleos).
Cromossomos interfásicos manchados com DAPI dentro de um núcleo de células fibroblásticas do pulmão CCD37LU fixadas em 3:1 metanol:ácido acético também foram medidas, como mostrado na Fig. 7a. A imagem mostra a presença de regiões de curta vida dentro do núcleo, semelhante à observada nas células linfocitárias GM18507. Entretanto, as regiões de curta vida não têm localização preferencial dentro do núcleo. A Figura 7b mostra a imagem do FISH do núcleo medido. A sonda do cromossoma 9 centromero é mostrada como vermelha na imagem. Comparando a Figura 7a,b, pode-se observar que a localização da sonda do cromossoma 9 centromero se sobrepõe à das duas regiões de curta vida útil. Outro núcleo medido mostra um resultado semelhante e é apresentado na Figura S8.
FLIM do núcleo interfásico das células CCD37LU.
(a) Imagem do núcleo em tempo de vida. As regiões de curta vida encerradas num quadrado a tracejado vermelho foram identificadas como parte do cromossoma 9 (barra de escala = 5 μm). (b) Imagem FISH do núcleo medido mostrando a localização da sonda centrômero para o cromossomo 9 (barra de escala = 5 μm). A localização da sonda sobrepõe-se à das regiões fechadas de curta duração na Fig. 7a.