Excited State kenmerken van vrije DAPI en DAPI gebonden aan DNA
De aangeslagen toestand levensduur van DAPI is goed bekend26, dus hebben we gemeten de levensduur van ongebonden DAPI in PBS-oplossing (pH 7.2) om zowel de gevoeligheid van het systeem als de nauwkeurigheid van de levensduurmetingen te bepalen. De fluorescentie verval toonde een dubbel exponentieel karakter: fluorescentie levensduur componenten, τ en intensiteit coëfficiënten, a, worden gerapporteerd in tabel 1. De waarde van de lange levensduur component komt goed overeen met de literatuur, terwijl de waarde van de korte levensduur component hoger is dan die beschreven in de literatuur bij pH 7, waar de waarde tussen 0,19-0,24 ns26 ligt.
We hebben vervolgens de levensduren gemeten van DAPI gebonden aan DNA dat verschillende hoeveelheden AT- en GC-basen bevat, om te bepalen of de samenstelling van de DNA-basen van invloed is op de levensduur van DAPI. Kalf thymus (CT) en micrococcus luteus (ML) DNA werden gebruikt voor dit deel van de studie vanwege hun verschillende basenpaar samenstelling (42% GC voor CT DNA en 72% GC voor ML DNA). Er werden drie oplossingen van zowel CT- als ML-DNA gemeten. De DAPI-looptijden voor elk type DNA vertoonden twee componenten (tabel 1). De korte levensduur component van DAPI gebonden aan ML DNA is iets hoger dan die van de CT DNA (130 ps verschil). Er is geen significant verschil waargenomen tussen de lange levensduur componenten.
FLIM van DAPI gebonden aan vaste metafase chromosomen van B-Lymfocyten
Figuur 1a toont een levensduur beeld van een typische “spread” van de menselijke metafase chromosomen vast in 3:1 methanol: azijnzuur (zie Methoden voor de definitie van chromosoom spread). Een uitgebreid beeld van de ingesloten regio in de figuur genomen bij een hogere pixel resolutie wordt getoond in Fig. 1b. Valse kleur wordt gebruikt om de levensduur waarde op elk beeld pixel.
Variaties in DAPI levensduur langs de lengte van de chromosomen.
Looptijd beelden van (a) een chromosoom verspreid (schaal bar = 10 urn) en (b) een uitgebreid beeld van de ingesloten regio in Fig. 1a genomen op een hogere pixel resolutie met chromosomen 1 en 9 (schaal bar = 2 urn). Figuur 1b inzet: genormaliseerde DAPI fluorescentie verval curves op geselecteerde pixels van de rode, groene en blauwe regio’s in chromosoom 9 in Fig. 1b. Het bereik van de levensduur kleurenschaal loopt van 2,50 ns (rood) tot 3,14 ns (blauw), zoals weergegeven.
Beide figuren laten zien dat er een variatie in de levensduur van DAPI langs de lengte van de chromosomen. De DAPI fluorescentie verval curves met genormaliseerde intensiteiten worden ook gepresenteerd in Fig. 1b om de levensduur beelden aan te vullen en laten zien dat de fluorescentie van de DAPI moleculen in de rode regio’s een sneller verval dan die in de blauwe regio’s heeft. De gemiddelde levensduur ± standaarddeviatie (SD) van DAPI voor de gemeten chromosoom spreiding in Fig. 1a werd bepaald op 2,91 ± 0,12 ns, de fluorescentie verval van DAPI bleek enkele exponentiële karakteristiek.
Identificatie van heteromorfe regio’s in chromosomen
Twaalf chromosoom spreidingen (GM18507 cellen) met 46 chromosomen elk werden gemeten uit drie dia’s. Figuur 2a toont een levensduur beeld van een van de gemeten spreads. In elk van de gemeten spreads vonden we dat bepaalde chromosomen specifieke regio’s langs hun lengte die significant kortere levensduur dan de rest van het chromosoom, meestal in de nabijheid van de centromeren hebben. Deze regio’s verschijnen rood in de levensduur beelden als gevolg van de gebruikte kleurenschaal, we zullen naar hen verwijzen als korte levensduur regions.
Identificatie van heteromorfe regio’s in chromosomes.
(a) Lifetime beeld van een chromosoom verspreid met pijlen die de heteromorfe regio’s (schaal balk = 10 pm). (b) Genormaliseerde levensduur distributie curves voor de heteromorfe regio’s en de rest van de chromosomen met kortere DAPI levensduur voor de heteromorfe regio’s dan voor de rest van de chromosomen. (c) mFISH beeld van de gemeten chromosoom verspreiding. (d) Karyotypering van de chromosomen in Fig. 2a,c op basis van color.
De levensduur distributie curves met genormaliseerde frequenties voor de korte levensduur regio’s en de rest van de chromosomen in Fig. 2a worden getoond in Fig. 2b. De gemiddelde levensduur ± SD van DAPI moleculen in de korte levensduur regio’s in Fig. 2a werd bepaald op 2,48 ± 0,13 ns, terwijl dat voor de moleculen in de rest van de chromosomen in de verspreiding werd bepaald op 2,80 ± 0,09 ns. De standaardafwijkingen vertegenwoordigen hoe gevarieerd de levensduur waarden zijn binnen de korte levensduur regio’s en de rest van de chromosomen voor de gemeten spread.
We vermoedden dat de korte levensduur regio’s kwamen overeen met heteromorfe regio’s in chromosomen. Dergelijke regio’s vertonen variaties in morfologie op specifieke locaties, terwijl ze het fenotype niet beïnvloeden, en zijn vaak heterochromatisch van aard. Bekende morfologische variaties van heteromorfe regio’s zijn in verband gebracht met levensduur en onvruchtbaarheid en zijn dus van groot belang in genetische studies. Het is bekend dat heteromorfe regio’s voorkomen op de chromosomen 1, 9, 15, 16 en het Y-chromosoom27.
Op alle gemeten spreidingen werden mFISH-experimenten (zie Methoden) uitgevoerd om de chromosomen te identificeren die de regio’s met een korte levensduur bevatten. De mFISH beeld en karyotype van de verspreiding in Fig. 2a worden getoond in Fig. 2c,d, respectievelijk. De regio’s met kortere levensduur, in vergelijking met de rest van de chromosomen, in alle gemeten spreidingen werden geïdentificeerd als de pericentromeric regio’s van chromosomen 1, 9 en 16, de korte arm van chromosoom 15 en de distale regio van chromosoom Y, deze regio’s zijn bekend als heteromorfe regio’s, de bevestiging van onze hypothese.
Tabel 2 toont de gemiddelde levensduur waarde van DAPI voor elk van de heteromorfe regio’s in Fig. 2a. Aangezien elk autosoom tweemaal verschijnt, werden de gemiddelde levensduur en standaardafwijkingen voor de heteromorfe regio’s verkregen voor autosomen met hetzelfde chromosoomnummer gemiddeld en samengevoegd, respectievelijk.
Uit de tabel kan worden opgemaakt dat de gemeten levensduren voor de heteromorfe regio’s van de chromosomen 1, 16 en Y vergelijkbaar zijn en aanzienlijk langer zijn dan die van de chromosomen 9 en 15. De heteromorfe regio van chromosoom 9 kan worden beschreven door twee levensduren, zodat regio 9a een vergelijkbare waarde heeft als die van chromosoom 15, terwijl regio 9b een kortere levensduur heeft dan die van regio 9a.
De andere gemeten spreidingen (zie de tabellen S1-S11 in het aanvullend materiaal) vertonen een soortgelijke trend dat de heteromorfe regio’s van de chromosomen 9 en 15 kortere levensduren hebben dan die van de chromosomen 1, 16 en Y.
Trends in DAPI levensduur met chromosoom gebied
Chromosomen zijn bekend dat ze geleidelijk compacter als ze de metafase stadium van de celcyclus te benaderen; Colcemid werd gebruikt voor deze studie om de cellen te blokkeren in dit stadium voor het oogsten. Van de cellen in de gesynchroniseerde populatie wordt echter niet verwacht dat zij zich bij de oogst precies in hetzelfde stadium van de verdichting bevinden. Deze variatie in de verdichting wordt weerspiegeld in de variatie in het relatieve gebied van een bepaald chromosoom van een chromosoom verspreid naar een ander op dezelfde dia, met de meer compacte chromosomen met kleinere gebieden. We verwachtten dat verschillende staten van verdichting zou een effect op de fluorescentie waargenomen levensduren hebben. Om het effect van chromatine verdichting op de levensduur te meten, hebben we gecorreleerd het gemiddelde DAPI levensduur voor verschillende voorbeelden van chromosoom 1’s (GM18507 cellen) van een dia en hun heteromorfe regio’s met de gemeten chromosoom gebied. Zoals eerder beschreven, werden de levensduur waarden voor chromosoom paren gemiddeld, pixels een kleur toegewezen op basis van de levensduur waarde en korte levensduur regio’s (rode regio’s) werden genomen om heteromorfe van aard zijn. Segmentatie en analyse van de heteromorfe regio’s en de berekening van de chromosoom gebieden werden uitgevoerd met behulp van de Avizo software.
De grafiek in Fig. 3 blijkt dat de gemiddelde levensduur van DAPI voor chromosoom 1 en de heteromorfe regio sterk afnemen met afnemende chromosoom 1 gebied. In de mate waarin de oppervlakte van een chromosoom in een spreiding de pakkingsdichtheid vertegenwoordigt, suggereert de waargenomen trend een lineaire afhankelijkheid van de dichtheid, die de mate van condensatie vertegenwoordigt. Een soortgelijke trend wordt ook waargenomen voor chromosoom spreads op een andere dia (zie figuur S1).
Mean fluorescentie levensduur van DAPI voor verschillende chromosoom 1’s en hun heteromorfe regio’s uitgezet tegen het gebied van de chromosomen.
De foutbalkjes vertegenwoordigen de standaardafwijking. Aldus DAPI is gevoelig voor zowel algemene chromosoom lengte compacties als gelokaliseerde sub-chromosoom condensation.
Effect van DAPI Concentratie op de levensduur
De gemiddelde DAPI levensduur voor verschillende chromosomen 1’s (GM18507 cellen) gekleurd met verschillende DAPI concentraties werden gemeten om het effect van DAPI concentratie op de levensduur te bepalen. Twaalf chromosoom 1’s, met ongeveer dezelfde oppervlakte, van hetzelfde objectglaasje werden gemeten voor elke concentratie.
Uit tabel 3 kan worden opgemaakt dat de totale intensiteit van chromosoom 1 toenam naarmate de concentratie DAPI werd verhoogd. Er werd echter geen significante variatie waargenomen in de DAPI-levensduur tussen de verschillende concentraties.
FLIM van Hoechst 33258 gebonden aan vaste metafase chromosomen
Om te bevestigen dat de levensduur variaties die we hebben waargenomen langs de lengte van de chromosomen is een functie van chromatine structuur en niet te wijten aan eventuele effecten die specifiek zijn voor DAPI, voerden we FLIM met behulp van een andere kleine-groef binding kleurstof. Metafase chromosomen (GM18507 cellen) gefixeerd in 3:1 methanol: azijnzuur werden gekleurd met Hoechst 33258.
Figuur 4 toont de levensduur beeld van de gemeten chromosoom spreiding. De fluorescentie verval van Hoechst 33258 gebonden aan de chromosomen bleek enkele exponentiële kenmerken, vergelijkbaar met die van DAPI hebben. De gemiddelde levensduur ± SD van Hoechst 33258 voor de gemeten verspreiding werd bepaald op 2,42 ± 0,05 ns. De kleinere standaardafwijking, in vergelijking met die van de DAPI-bekleurde chromosomen (0,12 ns), blijkt dat de variatie in de Hoechst 33258 levensduur over de verspreiding niet zo hoog is als die waargenomen voor de DAPI-bekleurde chromosomen. De levensduur beeld toont aan dat de heteromorfe regio’s van chromosomen 1, 9, 15, 16 en Y aanzienlijk kortere levensduur waarden weergegeven dan de rest van de chromosomen (zie figuur S2 voor de mFISH beeld en karyotype), vergelijkbaar met die waargenomen voor de DAPI-gekleurde chromosomen. De gemiddelde levensduur ± SD van Hoechst 33258 moleculen in de heteromorfe regio’s werd bepaald op 2,36 ± 0,03 ns, terwijl dat voor de moleculen in de rest van de chromosomen in de verspreiding werd bepaald op 2,43 ± 0,04 ns. De gemiddelde Hoechst 33258-levensduurwaarden en standaardafwijkingen voor elk van de heteromorfe gebieden van de chromosomen 1, 9, 15, 16 en Y, in vergelijking met de rest van het chromosoom, worden gepresenteerd in tabel S12.
Lichtbeeld van een chromosoomspreiding gekleurd met Hoechst 33258 met pijlen die de heteromorfe regio’s aangeven (schaalbalk = 10 μm).
Dit extra experiment met Hoechst bevestigt dat de levensduur variaties waargenomen langs de lengte van de chromosomen worden veroorzaakt door de lokale chromatine structuur en niet de gebruikte fluorofoor.
FLIM van DAPI gebonden aan vaste metafase chromosomen van HeLa Cellen
FLIM metingen op DAPI-gekleurde metafase chromosomen verkregen uit HeLa-cellen gefixeerd in 3:1 methanol: azijnzuur werden ook uitgevoerd om te controleren of de variaties in de DAPI levensduur waargenomen langs de lengte van de chromosomen zijn niet alleen cellijn specifiek, maar zijn te wijten aan de algemene chromatine structuur.
Figuur 5a toont de gemeten chromosoom spreiding. De gemiddelde levensduur ± SD van DAPI voor de gemeten verspreiding werd bepaald op 2,93 ± 0,09 ns. Kortere DAPI levensduur, in vergelijking met de rest van de chromosomen, worden waargenomen op de heteromorfe gebieden van chromosomen 1, 9, 15, 16 en Y (zie figuur S3 voor de mFISH beeld en karyotype), vergelijkbaar met die waargenomen voor de GM18507 cellen. Vier abnormale chromosomen bestaande uit een deel van een van beide chromosoom 1 of 9 vertoonde ook de kortere DAPI levensduur in hun pericentromeric regio’s suggereren dat ze de heteromorfe regio van chromosoom 1 of 9 bevatten. De levensduur distributie curves met genormaliseerde frequenties voor de korte levensduur regio’s en de rest van de chromosomen worden getoond in Fig. 5b. De gemiddelde levensduur van de DAPI-moleculen in de korte levensduur regio’s werd bepaald op 2,68 ± 0,08 ns, terwijl die voor de moleculen in de rest van de chromosomen in de verspreiding werd bepaald op 2,93 ± 0,08 ns.
Identificatie van heteromorfe regio’s in chromosomen verkregen uit HeLa-cellen.
(a) Lifetime beeld van een chromosoom spreiding met pijlen die de heteromorfe regio’s. De chromosomen ingesloten in een geel gestippeld vierkant zijn de abnormale chromosomen (schaal bar = 10 pm). (b) Genormaliseerde levensduur distributie curves voor de heteromorfe regio’s en de rest van de chromosomen met kortere DAPI levensduur voor de heteromorfe regio’s dan voor de rest van de chromosomen.
FLIM van DAPI gebonden aan interfase chromosomen binnen vaste kernen
De levensduur van DAPI gebonden aan interfase chromosomen binnen een 3:1 methanol: azijnzuur vaste kern van de GM18507 lymfocyten cellijn werd ook afgebeeld, zoals getoond in Fig. 6. Een z-stack van de kern werd genomen met behulp van een multiphoton excitatie (bij 760 nm) confocale microscoop. Fig. 6a, c tonen beelden verkregen op -0,50 urn en +0,50 urn, respectievelijk, van het oorspronkelijke brandpuntsvlak (Fig. 6b).
Geselecteerde brandpuntsvlakken van de z-stack van de levensduur beelden van interfase kern van GM18507 cellen op (a) -0,50 urn, (b) 0 urn en (c) +0.50 urn focus (schaalstaven = 5 urn, zie figuur S5 voor alle brandpuntsvlakken in de z-stack).
Een enkele exponentiële karakter werd waargenomen voor de DAPI fluorescentie verval. De levensduurbeelden van de gemeten kern tonen aan dat er een sterke variatie is in de DAPI-levensduur over de interfase-kern, waar gelokaliseerde regio’s met korte levensduren kunnen worden waargenomen (aangegeven met pijlen in fig. 6). Hoewel de gefixeerde kern enigszins is ingezakt ten opzichte van zijn inheemse bolvorm als gevolg van het fixatieproces, toont dit de locaties van de korte levensduur regio’s in drie dimensies. 3D-reconstructie van de confocale z-stack beelden (zie figuur S4) en kwantitatieve analyse van de korte levensduur regio’s werden uitgevoerd met behulp van de Avizo software.
Tabel 4 toont het volume, de gemiddelde levensduur en de positie ten opzichte van de straal van de kern van de korte levensduur regio’s. De berekende volumes voor de korte levensduur regio’s blijken groter te zijn dan het typische volume van een metafase chromosoom (~ 1-3 um3), wat suggereert een aanzienlijke decompactie van chromatine in interfase. De posities van de korte levensduur regio’s werden berekend om te bepalen of ze hebben preferentiële locaties in de kern. Uit de tabel blijkt dat de korte levensduur regio’s zich dichter bij de periferie dan bij het centrum van de celkern bevinden. We onderzochten drie kernen in deze studie en vonden dat alle toonden een vergelijkbare verdeling van de korte levensduur regio’s (zie figuren S6 en S7 voor de andere twee kernen).
DAPI-gekleurde interfase chromosomen binnen een kern van CCD37LU long fibroblast cellen gefixeerd in 3:1 methanol:azijnzuur werden ook gemeten, zoals getoond in Fig. 7a. Het beeld toont de aanwezigheid van korte levensduur regio’s binnen de kern, vergelijkbaar met die waargenomen in de GM18507 lymfocyten cellen. De korte levensduur regio’s hebben echter geen preferentiële locatie binnen de kern. Figuur 7b toont het FISH-beeld van de gemeten kern. Chromosoom 9 centromeer probe wordt weergegeven als rood in het beeld. Vergelijking van fig. 7a,b, kan worden waargenomen dat de locatie van het chromosoom 9 centromeer probe overlapt met die van de twee van de korte levensduur regio’s. Een andere gemeten kern toont een soortgelijk resultaat en wordt gepresenteerd in figuur S8.
FLIM van interfase kern van CCD37LU cellen.
(a) Lifetime beeld van de kern. De korte levensduur regio’s ingesloten in een rood gestippeld vierkant werden geïdentificeerd als onderdeel van chromosoom 9 (schaal bar = 5 pm). (b) FISH beeld van de gemeten kern met de locatie van de centromeer probe voor chromosoom 9 (schaal bar = 5 urn). De locatie van de probe overlapt met die van de ingesloten korte levensduur regio’s in Fig. 7a.