Bestemmelse af organiske sporstoffer i fødevareanalyser er af stor betydning for fødevarekvalitet og fødevaresikkerhed. Både adskillelse af analysanden fra potentielle inferenser i fødevarematrixen og kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af målforbindelsen er afgørende trin i analytisk fødevarekemi.
Definition
Væskekromatografi (LC, her High Performance LC – HPLC) er en fysisk separationsteknik til sporanalyse. Den er baseret på interaktion mellem en analysand og en stationær fase (kolonne med partikler) og en mobil fase (flydende eluent eller en blanding af eluenter). Massespektrometri (MS) er et analytisk værktøj til måling af en prøves sammensætning. MS genererer nyttige oplysninger om analyters molekylvægt og struktur og hjælper med at klarlægge ukendte forbindelser.
Kombinationen, LC/MS, LC-MS er en kraftfuld teknik på grund af dens meget høje følsomhed (op til ppt-området) og specificitet. Inden for organisk sporanalyse anvendes MS til mange anvendelser, men i modsætning til GC/MS (gaskromatografi, koblet med massespektrometri) er den dedikeret til analyse af prøver, der indeholder ikke-flygtige analytiske mål, typisk med en masse mellem 200 – 800u, som er termisk labile, udviser høj polaritet eller har en høj molekylær masse.
Webinar: Dette webinar omhandler den rolle, som testning af fødevarers ægthed kan spille i en strategi til forebyggelse af fødevaresvig
Dette webinar omhandler den rolle, som testning af fødevarers ægthed kan spille i en strategi til forebyggelse af fødevaresvig. Det fremhæver også behovet for et holistisk synspunkt, der omfatter identifikation af risici, gennemførelse af en plan for forebyggelse af fødevaresvig, styring af forsyningskæden, virksomhedens kultur for fødevaresikkerhed og laboratorieundersøgelser.
REGISTRER DIG NU
Arbejdsprincip
I princippet skal en LC/MS-enhed udføre de fire arbejdstrin, herunder:
- Kromatografisk adskillelse af analytterne ved hjælp af en separationskolonne
- Ionisering af analysanden
- Isolering af ionerne og
- Identificering af ionerne
Generelt er det ikke trivielt at forbinde et HPLC-system med et massespektrometer, da vanskeligheden består i at omdanne en opløst stof til en ion i gasfasen. Udfordringen består i at slippe af med opløsningsmidlet, samtidig med at der opretholdes et tilstrækkeligt vakuumniveau i massespektrometeret, og at generere gasfaseionerne. Derfor indføres komponenter, der elueres fra den kromatografiske kolonne, i massespektrometeret via en specialiseret grænseflade.
De to mest udbredte ioniseringsgrænsefladesystemer, kemisk ionisering ved atmosfæretryk (APCI) og elektrosprayionisering (ESI), vælges afhængigt af de fysisk-kemiske egenskaber ved analysanderne (dvs. polaritet og surhedsgrad). Ioniseringen finder sted ved atmosfærisk tryk, og begge anses for at være en blød ioniseringsmetode, dvs. at massespektret hovedsagelig giver oplysninger om molekylvægt, medmindre der anvendes fragmenteringsteknikker.
Da forbindelser delvist co-eluterer fra det kromatografiske system, kan en klar tildeling af de enkelte fragmenter ikke foretages udelukkende ved hjælp af LC-MS, hvor kun molekylærionmasser er tilgængelige. For at løse dette problem anvendes der i dag hovedsagelig tandem-massespektrometri (MS/MS), som omfatter flere trin af massevalg eller analyse (LC/MS/MS/MS eller LC/MSn). Disse systemer er i stand til at bestemme restkoncentrationer i det lavere ppt-område. Til kvalificering af organiske molekyler er det nødvendigt med en anden teknisk MS-opsætning. En mulig metode til kvalificering er anvendelse af en MS, der genererer ioner, leder dem til en lineær ionfælde og derefter lagrer dem i et radiofrekvensfelt. Herefter giver forskellige tekniske muligheder mulighed for at kvalificere ionerne og dermed den ukendte forbindelse.
Anvendelser
Siden dens indførelse i rutineanalyser for ca. ti år siden er LC/MS blevet etableret inden for de fleste områder af analytisk kemi, f.eks. kvalitetskontrol, grundforskning og anvendt forskning samt myndighedskontrol.
De følgende eksempler giver en kort oversigt:
a) Farmaci
- Farmakokinetiske undersøgelser af lægemidler, f.eks. nedbrydningsprocesser for lægemidler
- Medicinudvikling, f.eks. identifikation af metabolitter eller identifikation af urenheder
b) Molekylærbiologi
- Proteomik, f.eks. undersøgelse i stor skala af proteiner, navnlig deres strukturer og funktioner
- Metabolomik, f.eks.f.eks. bestemmelse af metaboliske mellemprodukter, hormoner og andre signalmolekyler
c) Miljø
- Affaldsvand, f.eks. endokrine forbindelser
- Bjord, f.eks. organometalliske stoffer
d) Fødevarer
- Ingredienser, f.eks. aminosyrer, lipider
- Forurenende stoffer, f.eks. multiresidualanalyse af pesticider, toksiner fra fisk og skaldyr, veterinærrester, bestemmelse af farvestoffer, akrylamid, analyse af mikrocystiner
- Naturlige produkter, f.eks. terpener, steroider
Perfluorerede tensider (PFC) som et eksempel på fødevareanalyse
Baggrund
PFC er et glimrende eksempel på at kombinere kompleks prøveforberedelse med sofistikerede LC/MS-apparater og en dybtgående viden om analytisk kemi. PFT’s unikke egenskaber gør dem nyttige i en række industrielle og kommercielle produkter som f.eks. kølevæsker, polymerer og som komponenter i lægemidler og pesticider. Især perfluorerede carboxylater (f.eks. PFOA – perfluoroktansyre) og perfluorerede sulfonater (f.eks. PFOS – perfluoroktansulfonsyre) anvendes som overfladeaktive stoffer, f.eks. til imprægnering af tekstiler og tæpper, i skum til brandslukning og til fedtafvisende behandlinger i papirindustrien. PFC er blevet produceret i over 50 år og distribueres nu over hele verden. Hvis C-H-bindinger ikke er fuldt ud erstattet af C-F-bindinger, en af de stærkeste kemiske bindinger, der kendes, er nedbrydning stadig mulig.
Kun PFOA og PFOS er toksikologisk vurderet (kronisk toksisk og kræftfremkaldende), alle andre homologe forbindelser, isomerer osv. er endnu ikke vurderet. Ud fra et fysisk synspunkt er PFC både persistente (dvs. ikke nedbrydelige) og mobile (dvs. kan udvaskes fra forurenet jord til grundvandet). Dette udgør en permanent trussel i forbindelse med drikkevandsindvinding og/eller -konditionering. Desuden indføres disse forbindelser i fødekæden ved overførsel fra planter.
Den store PFC-forurening i to tyske floder i 2006 vakte offentlig interesse for disse forbindelser.
Forureningen i 2006 kan stamme fra organisk slam, der blev anvendt som gødning til landbrugsformål. Det blev påvist, at jorden indeholder op til 600 µg PFC/kg, hvilket har forårsaget forurening af drikkevand og forsyningsanlæg. Indtil videre har syv tyske delstater rapporteret om PFC-forurening.
Fraunhofer IME
En af Fraunhofer-instituttet for molekylærbiologi og anvendt økologi’s kernekompetencer er udvikling af gennemførlige og pålidelige metoder til identifikation og analyse af kemiske forurenende stoffer i fødevarer og miljømatricer.
Siden 1999 har Fraunhofer IME gennemført projekter til måling af PFC-forurening i forskellige miljømatricer. Dette arbejde er blevet udført på vegne af industrielle partnere og har især fokuseret på PFC-carboxylater og PFC-sulfonater. Yderligere undersøgelser blev gennemført på vegne af overvågningsprogrammet i den tyske miljøprøvebank, som også omfattede blodprøver fra mennesker. I 2005 blev de første undersøgelser på fødevareområdet gennemført, og i 2006 blev resultaterne af udvalgte fødevareprøver (f.eks. modermælk og pommes frites) også drøftet i medierne. I 2007 blev der gennemført større projekter med fokus på planteoverførsel, kartofler og produkter, menneskelige matricer (blod og modermælk) samt miljøprøver (f.eks. spildevand, slam og jord).
Analytisk løsning
Der blev anvendt tre forskellige prøveforberedelser for at dække alle mulige prøvematricer:
- IPE (ion par ekstraktion). Anvendelse af ionparringsmidlet tetra-n-butylammoniumhydrogensulfat efterfulgt af en flydende faststofekstraktion (f.eks. miljøprøver)
- AAE (syre-alkalisk ekstraktion). Fjernelse af lipiderne med hexan ved pH 14 (flydende ammoniakopløsning), justering til pH 1 med saltsyre og ekstraktion med tert-butylmethylether (f.eks. modermælk)
- SPE (fastfaseekstraktion, i øjeblikket den mest citerede metode) med patroner af forskellig polaritet afhængig af PFC’ens ioniske karakter i et buffermedie (f.eks.f.eks. kartoffel)
Anvendelse af interne standarder til kalibrering anbefales stærkt; i øjeblikket omfatter vores metoder ni massemærkede PFC-standarder. Inden prøverne føres ind i LC/MS, skal selve apparatet kontrolleres for teflonbelagte reservedele, da de indeholder emitterende PFC, som vil påvirke resultaterne på en ikke-reproducerbar måde. Disse dele skal udskiftes, hvilket kræver et godt kendskab til LC/MS-komponenterne.
Analytisk eksempel
Til analyser af rå kartofler og kartoffelprodukter justerede vi vores LC/MS/MS (HPLC Alliance 2695 med Quattro Ultima Pt i Electrospray negativ mode, begge Waters; 150 x 2 mm Luna 3 µm C18(2)-kolonne, Phenomenex) til målmasser af 9 perfluorkarboxylsyrer (C4 – C12) og 3 perfluorsulfonsyrer (C4, C6, C8) ved hjælp af 13C-mærkede referencematerialer (LOQ 0.5 µg/Kg) efter en SPE-prøveforberedelse.
PFC’er viste forskellig fordeling i rå kartofler og i kartoffelprodukter (tabel 1), hvilket giver mulighed for at antage en forurening under forarbejdningen samt en jordforurening. Dette kan understøttes af vores undersøgelser af PFC-pommes frites fra 2006, hvor vi analyserede pommes frites fra fastfoodrestauranter og fandt op til 2,8 µg PFOA/kg og op til 0,9 µg PFOS/kg.
Analyseudsigter
Fraunhofer IME har betydelig ekspertise og erfaring med PFC-analyser, som kan anvendes på mange områder af PFC-forurening i miljø/fødevarer, som endnu ikke er blevet undersøgt. Vigtige områder for fremtidig PFC-forskning kan omfatte udvidelse af antallet af analyter, mange kort- og langkædede PFC er allerede inkluderet i vores undersøgelsesprogram, men vores analytiske kapacitet kunne opgraderes ved at inkludere yderligere PFC. De yderligere PFC skal identificeres ved hjælp af LC/MS, fordi der ikke findes kommercielle standarder. Dette vil føre til konsoliderede resultater vedrørende forløbere, fødevarekontaminationsveje og nedbrydning under forarbejdning af fødevarer.
