PMC

Autotomi synes at have udviklet sig flere gange blandt pattedyr, men er taxonomisk sparsomt forekommende. Dokumenteret autotomi er typisk begrænset til halen og sker ved tab af haleskeden (falsk autotomi) eller ved brud på tværs af ryghvirvlerne (ægte autotomi)2,5. Ud over haleautotomi er der tilfældigt blevet henvist til pattedyrarter med svag eller skrøbelig hud, selv om det fortsat er uvist, om disse dyr er i stand til at foretage hudautotomi. Derfor forsøgte vi først at undersøge anekdotiske beviser for, at to arter af afrikanske pigmus (Acomys kempi og Acomys percivali) let smider dele af deres hud som en adfærd til at undslippe rovdyr.

For at teste hypotesen om, at A. kempi og A. percivali er i stand til hudautotomi, fangede vi levende individer i fælder på klippefremspring (kopjes) i det centrale Kenya. Ud over beskyttelseshårene er arter i slægten Acomys bemærkelsesværdige for tilstedeværelsen af pigtrådslignende hår på ryggen (Fig. 1a, b). Ved håndtering af begge arter i felten blev det bekræftet, at kraftige bevægelser ofte førte til, at huden blev revet i stykker. Det resulterede i store åbne sår eller hudtab, der varierede fra små stykker til områder på ca. 60 % af den samlede rygoverflade (fig. 1c). Ud over tab af integumenter udviste begge arter autotomi af haleskeden, som tidligere rapporteret for andre Acomys-arter, og individer blev ofte fanget med manglende haler2. Blandt individer i fangenskab observerede vi, at alvorlige hudsår helede hurtigt, og at den hurtige genvækst af pighår fuldstændig skjulte det sårede område (fig. 1d, e). Individer, der blev fanget i felten, viste lignende heling og i nogle tilfælde mønstrede hårsække i anagenfasen (dvs. vækstfasen), som så ud til at være regenereret i de sårede områder (Fig. 1f).

For at vurdere, hvordan Acomys-skindet river så let, spurgte vi, om de mekaniske egenskaber ved Acomys-skindet kunne ligge til grund for den observerede svaghed. Baseret på eksperimenter med undersøgelse af hudautotomi hos gekkoer3 kan der skelnes mellem svag hud (dvs. hud med ensartede strukturelle egenskaber, der svigter eller går i stykker under relativt lav induceret belastning) og skrøbelig hud (dvs. hud med specifikke morfologiske karakteristika såsom et brudplan, der gør det muligt at frigøre de ydre lag). For at vurdere hudens svaghed sammenlignede vi de mekaniske egenskaber af Acomys- og Mus-hud. Under mekanisk belastning udviste Mus-huden elastiske egenskaber før bruddet, mens Acomys-huden var skør og begyndte at rive kort tid efter belastningen (fig. 2a). Vi udledte spændings-/forstrækningskurver fra rygskindet for at bestemme den gennemsnitlige trækstyrke (σm) og fandt, at Mus-skindet var 20 gange stærkere end Acomys-skindet (2,3 MPa ±0,19 og 0,11 MPa ±0,03) (fig. 2a, b). Endelig blev det ved beregning af den gennemsnitlige sejhed (W) konstateret, at der skulle næsten 77 gange mere energi til at bryde Mus-skindet end Acomys-skindet for at bryde det (fig. 2b). Disse resultater viser, at Acomys har en hud, der let rives (eller knækker) som reaktion på lavt påført spænding, og giver et mekanisk grundlag for deres huders svaghed.

For at vurdere, om de strukturelle egenskaber ved Acomys’ hud bidrog til dens mekaniske svaghed, undersøgte vi de cellulære træk ved A. percivali-huden og fandt, at den anatomisk set var sammenlignelig med huden hos Mus og andre gnavere, om end med meget større hårsække (Fig. 2c, d). Vi fandt ingen tegn på et brudplan, som er mekanismen for hudens autonomi hos gekkoer og skinks3. Ved undersøgelse af elastinfibre, som øger hudens elasticitet, fandt vi, at alle tre arter besad en lignende fordeling og overflod af elastin i dermis og under panniculus carnosus (Fig. S1a-f). Vi testede, om større hårfollikler i Acomys’ hud reducerede det samlede dermiske areal optaget af bindevæv ved at undersøge andelen af adnexa (f.eks. follikler og tilhørende kirtler) i dermis og fandt, at den var større hos A. percivali (55,61 % ±4,28) sammenlignet med M. musculus (43,65 % ±4,62) (t=1,9, P=0,043) (Fig. 2e, f) (Fig. 2e, f). Disse resultater tyder på, at selv om den grundlæggende vævsstruktur i Acomys’ hud ligner Mus, reducerer den plads, der er optaget af adnexa i dermis, det absolutte bindevævsindhold, hvilket potentielt bidrager til den nedsatte elasticitet og den lavere trækstyrke, når huden sættes under spænding6. Manglen på et brudplan understreger dette fund og understøtter en iboende strukturel forskel, der ligger til grund for Acomys-hudens observerede svaghed.

Givet dens iboende strukturelle svaghed og tilbøjelighed til at rive, vurderede vi Acomys’ evne til at helbrede hudsår ved hjælp af små (4 mm) og store (1,5 cm), fuld tykkelse excisionelle (FTE) sår. I sår af begge størrelser var der hurtigt dannelse af skurv og hæmostase, og i store sår bidrog det til en 64 % ± 3,1 reduktion i sårarealet 24 timer efter skaden (Fig. S2a). Under arfri heling i terrestriske salamandre7 og pattedyrfostre8 reepitheliseres sårbunden i løbet af flere dage, mens et 4 mm sår i voksen rottehud tager mellem 5-7 dage at reepithelisere9. Hos Acomys fandt vi, at fem ud af seks 4 mm-sår var fuldstændig reepitheliseret på dag 3 efter skaden (D3), mens Mus-sårene ikke reepitheliseredes så hurtigt (Fig. 2g, h). Efter re-epithelisering er pattedyr med løs hud (f.eks. gnavere, kaniner osv.) primært afhængige af kontraktion for at helbrede deres sår10. På samme måde observerede vi høje kontraktionshastigheder, som tegnede sig for 95 % af sårlukningen efter 17 dage (Fig. S2a-c). I modsætning til arvævsdannelse, hvor kollagenfibre organiserer sig i et tæt netværk parallelt med epidermis, antager kollagenfibre under arfri heling et mønster svarende til usåret dermis10. Ved undersøgelse af den ekstracellulære matrix (ECM) ved D10 observerede vi ardannelse hos Mus, mens collagenfibriller hos Acomys var mindre tæt pakket og indeholdt en mere porøs struktur (Fig. 2i, j). Ved hjælp af picrosirius rødt fandt vi, at kollagen type I dominerede sårbunden ved D10 i Mus, mens kollagen type III var mere udbredt i Acomys (Fig. 2k, l). Denne forskel var endnu mere udtalt i 1,5 cm store sår (Fig. S3a-b’). Tilsammen viser disse data, at hurtig reepithelisering og sammentrækning af sårkanten i høj grad reducerer størrelsen af åbne hudrevner hos Acomys. Vores resultater, at sårets ECM (1) aflejres langsomt, (2) har en porøs konfiguration, og (3) er domineret af type III kollagen, tyder på, at denne sammensætning favoriserer regeneration frem for fibrose under hudreparation hos Acomys.

For at teste sårmiljøets regenerative kapacitet udtog vi prøver af store helende sår for tegn på hårfollikel-neogenese og dermal regeneration. I forbindelse med den mere porøse ECM observerede vi follikulærgenese af normale pelshår og store pighår i sårbedet mellem D21 og D28, og vi kunne skelne gamle, store follikler nær sårranden fra nyligt regenererede follikler i sårbedet (Fig. 3a-d og Fig. S3c-e). Nye follikler syntes at regenerere i hele den ikke-kontraherede del af sårbedet og ikke kun i den centrale region (Fig. 3c og Fig. S3e), og vi observerede regenererende hårfollikler i forskellige udviklingsstadier (Fig. 3a-m og Fig. S4a-c). En lokaliseret og stærkt proliferativ population af epidermalceller driver hårfollikeludviklingen, og vi observerede et lignende fænomen under follikelregeneration (Fig. 3e og Fig. S4a-c). For at undersøge, om embryonale signalnetværk, der anvendes under hårfollikeludvikling, blev anvendt under hårfollikelregeneration, undersøgte vi Keratin-17 (Krt17); som er diffust udtrykt i epidermis under hududvikling og bliver gradvist begrænset til udviklende hårfollikler11. Efter reepithelisering var KRT17 stærkt beriget i hele neoepidermis, der lå over sårbedet ved D14, og efterhånden som nye hårfollikler blev dannet i sårbedet, blev KRT17 begrænset til follikelepitelet (Fig. 3f og Fig. S5). Under sårreparation i Mus fandt vi, at KRT17 også var stærkt opreguleret i den re-epitheliserede epidermis ved D14 (Fig. S5), og selv om KRT17 lokaliseret til nogle basale keratinocytter i Mus-epidermis ved D21, lykkedes det ikke disse steder at aggregere til placoder eller nye hårfollikler, således at KRT17 var helt fraværende fra den nye epidermis ved D26 (Fig. 3f). Forsvindingen af KRT17 fra basale keratinocytter i Mus, sammen med vores observation af fortsat lokalisering i nye placoder og hårfollikler i Acomys, tyder på, at de underliggende dermale signaler, der kræves for at inducere placode-dannelse i Mus, mangler.

Og selv om det præcise signal for placode-dannelse fortsat er uklart, er der et absolut krav om Wnt-signalering under normal follikeldannelse12. Nuklear lokalisering af LEF1-protein er blevet anvendt som en aflæsning af denne induktive signalering13. Vi påviste nukleær ophobning af LEF1 i regenererende epidermale placoder, kondenserende dermale fibroblaster under hårspiren og i dermal papilla- og matrixceller (Fig. 3g, h og Fig. S6a). Vi påviste også nukleær LEF1-farvning på lave niveauer i nogle ikke-placode basale keratinocytter, mens vi ikke påviste nukleær LEF1 i epidermis under sårheling i Mus, hvilket tyder på, at epidermal Wnt-aktivering i Acomys delvist kan ligge til grund for vores observation af regeneration af hårfollikel (Fig. S6b, c).

Regulering af kanonisk Bmp-signalering spiller også en rolle under induktion af hårfollikel og differentiering af follikulære progenitorpopulationer til den modne hårfollikel (gennemgået i14). Fosforylering af SMAD 1, 5 og 8 (pSMAD1/5/8) er en robust aflæsning af den kanoniske Bmp-signalering. Vi påviste pSMAD1/5/8 på lave niveauer under follikelinduktion og senere på højere niveauer i dermal papilla og matrixceller, der er under differentiering i hårløg (Fig. 3i, j). Derudover påviste vi SOX2-positiv dermal papilla i nogle regenererende hårfollikler, hvilket er i overensstemmelse med dens rolle i specificeringen af forskellige hårtyper under udviklingen af hårfollikel i musen15 (Fig. 3k). Samlet set viser disse resultater, at regenererende hårfollikler i Acomys udvikler sig gennem definerede stadier af hårfollikeludvikling, udviser høje proliferationshastigheder og genanvender molekylære veje, der anvendes under embryonal hårfollikeludvikling, til at regenerere nye hårfollikler.

Voksne pattedyrs hud er normalt ikke i stand til at regenerere epidermalt afledte strukturer som reaktion på sår (f.eks. kirtler og hårfollikler). En undtagelse herfra er observationen af spontan follikulærgenese i store excisionssår hos kaniner og for nylig hos forsøgsmus (C57BL6/SJ, SJL eller blandet stamme)16,17,18. Kaniner er også en af de få pattedyrarter, der er i stand til at regenerere store ørestiksår19. Vi antog, at den regenerative kapacitet, der er observeret hos Acomys, også kunne omfatte deres ørevæv. For at teste dette lavede vi 4 mm store stempler gennem ørerne på begge Acomys-arter, og til vores overraskelse fandt vi, at de var i stand til at lukke disse store stempler (fig. 4a-c og fig. S7a-c). Uskadet ørevæv indeholder hud (epidermis og dermis), tilhørende hårsække, fedtceller, muskler og brusk; vi fandt, at Acomys var i stand til at regenerere alle disse væv fuldstændigt med høj nøjagtighed undtagen muskler (fig. 4b-c). Tolv dage efter skaden observerede vi en ophobning af celler omkring omkredsen af såret under epidermis, og selv om regenerationen af nyt væv var centripetal, ophobede cellerne sig i højere grad på den proximale side af stemplet. Hårfollikel- og bruskregeneration foregik i en proximal til distal bølge (Fig. 4d, e), og i lighed med huden aktiverede follikulær epidermis i øret Wnt-signaleringen (Fig. S6d, e). I modsætning til Acomys fandt vi, at Mus ikke var i stand til at regenerere 4 mm ørestikler og i stedet dannede arvæv (Fig. S8a, b). Det er interessant, at på trods af ar-dannelse resulterede Mus øre-reparation i de novo-dannelse af bruskkondensationer distalt fra den afskårne brusk, hvilket tyder på, at Mus kan initiere, men ikke opretholde, et regenerativt respons efter øresår (Fig, S8b).

Det er fortsat uklart, om regeneration hos pattedyr foregår gennem dannelse af et blastema eller i stedet er en overdreven udgave af hyperplastisk vækst20,21,22. Blastemadannelse anses for at være et kendetegn for epimorfisk regeneration. Et kendetegn ved et regenerationsblastema er, at det indeholder prolifererende celler og opretholder proliferationen under regenerationen23. Vi observerede udbredt proliferation i hele øre-regeneratet hos Acomys og overraskende nok i hele det helende ørevæv hos Mus (fig. 4f, g). Vi bemærkede imidlertid en mangel på proliferation i den distale epidermis hos Acomys, mens vi påviste proliferation i hele Mus’ epidermis, der strakte sig til den distale spids (Fig. 4f, g). Mens proliferationen blev opretholdt i Acomys-ører, observerede vi næsten ingen prolifererende celler i Mus-ører i senere stadier (Fig. 4h, i).

Et andet kendetegn ved et blastema er dannelsen af et specialiseret epidermalt signalcenter (sår-epidermis), som er nødvendigt for, at prolifererende blastemalceller kan forblive i cellecyklusen24 og er karakteriseret ved et tab af epidermal stratificering, tab af basal keratinocytpolaritet og mangel på en moden basal lamina25. Efter re-epithelisering i Acomys bemærkede vi en fortykkelse af den distale epidermis, desorganisering af basale keratinocytter og fravær af en moden basalmembran (Fig. 4j). Til sammenligning udviste epidermis nær amputationsplanet normal stratificering og besad en fremtrædende basalmembran (Fig. 4k). I modsætning hertil syntes Mus kun at danne en sårepidermis i en forbigående periode efter reepithelisering, idet et forholdsmæssigt mindre distalt område udviste disse egenskaber i kort tid (data ikke vist). Ved D12 hos Mus afslørede kollagentype IV-farvning en moden basalmembran under hele epidermis i det helende øre (Fig. 4l). Desuden udviste epidermis normal stratificering og korrekt apikal-basal polaritet af de basale keratinocytter (Fig. 4g, l).

Ud over den vedvarende proliferation og dannelse af sårets epidermis spiller ekstracellulære matrix (ECM)-molekyler en central rolle ved at støtte proliferation og lede den efterfølgende differentiering under regenerering26. I modsætning hertil nedreguleres molekyler som laminin og kollagen type I, der fremmer differentiering, i blastemaet under regenerering af amfibiske lemmer og udtrykkes i takt med, at differentieringen af bevægeapparatet skrider frem26,27. Histologisk undersøgelse af Acomys-ører ved D12 afslørede høje niveauer af fibronectin (FN), en del tenascin-C (TN-C) omkring tætpakkede celler, men meget lave niveauer af kollagen type I (Fig. S9a-c). Kollagen type III var også mere rigeligt forekommende end kollagen type I under regenerationen (Fig. S9d-d’). TN-C blev begrænset fra områder, hvor ny brusk begyndte at differentiere sig, og inden for disse differentierende celler fandt vi aktivering af Bmp-signalvejen i celler, der giver anledning til ny aurikulær brusk (Fig. 4o og Fig. S10). Under den hyperplastiske vækst i Mus-ører viste ECM’en i begyndelsen høje niveauer af FN og lave niveauer af TN-C ligesom Acomys-ører, men producerede relativt højere niveauer af kollagen type I (Fig. S9e-g). Kollagenproduktionen i Mus var ikke blot hurtigere og mere rigelig, men udviste også et højere forhold mellem kollagen type I og III (Fig. S9h, h’). I betragtning af den overdrevne produktion af kollagen type I i Mus spurgte vi, om residente fibroblaster differentierede sig til myofibroblaster, som bidrager til ardannelse i stedet for regenerering (gennemgået i28). Ved hjælp af alpha smooth muscle actin (αSMA) fandt vi myofibroblaster i stor mængde i hele ørevævet i Mus, mens de var næsten helt fraværende i Acomys-ører (Fig. 4m, n). Disse data bekræfter betydningen af sårets ECM for at fremme proliferation, mens differentiering modvirkes, og understøtter tidligere arbejde, der viser, at tidlig kollagen type I-dannelse modvirker regeneration af vedhæng27.

Vores data tyder på, at reparativ øre regeneration hos Acomys er en balance mellem tidlig reformation af dermis (ardannelse) og opretholdelse af celleproliferation inden for et pro-regenerativt miljø. I modsætning hertil undlader Mus at danne (eller opretholde) en sår-epidermis, hvilket er sammenfaldende med tidlig dannelse af basalmembranen og stratificering af epidermis. Dette fører til tab af celleproliferation, øget kollagen type I-aflejring (i stedet for kollagen type III), myofibroblast-aktivering og i sidste ende til ar-dannelse. Selv om vores data tyder på, at øre regenerering deler lignende karakteristika med blastemadannelse, er det afgørende at forstå de molekylære signaler, der er nødvendige for at organisere og vedligeholde en sårepidermis og identificere de regenererende cellers afstamning, hvis vi skal finde ud af, hvordan regenerering finder sted hos disse dyr. Fremtidigt arbejde, der undersøger, hvordan Acomys er i stand til at kontrollere fibrose, vil kaste lys over, hvordan regeneration og ardannelse kan afbalanceres i lyset af infektion og inflammation i vilde pattedyr og udgør et ideelt modelsystem til at undersøge epimorfisk regeneration hos pattedyr.