En af de vigtigste procedurer inden for virologi er måling af virustiteren – koncentrationen af vira i en prøve. En meget anvendt metode til bestemmelse af mængden af smitsomt virus er plaque-assayet. Denne teknik blev først udviklet til at beregne titrene af bakteriofagebestandene. Renato Dulbecco modificerede denne procedure i 1952 til brug i dyrevirologi, og den er siden blevet anvendt til pålidelig bestemmelse af titre af mange forskellige virus.
For at udføre en plaque-assay fremstilles 10-dobbelte fortyndinger af en virusbestand, og 0,1 ml alikvater inokuleres på modtagelige cellemonolag. Efter en inkubationsperiode for at give virus mulighed for at binde sig til cellerne, dækkes monolagene med et næringsmedium, der indeholder et stof, sædvanligvis agar, som forårsager dannelsen af en gel. Når pladerne inkuberes, frigiver de oprindeligt inficerede celler virale afkom. Spredningen af de nye vira begrænses til nabocellerne af gelen. Hver infektiøs partikel danner derfor en cirkulær zone af inficerede celler, der kaldes en plak. Efterhånden bliver plakken stor nok til at være synlig for det blotte øje. Farvestoffer, der farvelægger levende celler, anvendes ofte til at forstærke kontrasten mellem de levende celler og plakkerne. Kun vira, der forårsager synlige skader på celler, kan undersøges på denne måde. Til venstre ses et eksempel på plaques dannet af poliovirus på et monolag af HeLa-celler. På dette billede er cellerne blevet farvet med krystalviolet, og plakkerne er let synlige, hvor cellerne er blevet ødelagt af virusinfektion.
Titeren af en virusbestand kan beregnes i plakdannende enheder (PFU) pr. milliliter. For at bestemme virustiteren tælles plakkerne. For at minimere fejlene tælles kun plader, der indeholder mellem 10 og 100 plaques, afhængigt af størrelsen af den cellekulturplade, der anvendes. Statistiske principper foreskriver, at når 100 plaques tælles, vil prøvens titer variere med plus eller minus 10 %. Hver fortynding udplottes i to eksemplarer for at øge nøjagtigheden. I eksemplet nedenfor er der 17 plaques på den plade, der er fremstillet af 10-6 fortyndingen. Virusoplagets titer er derfor 1,7 x 108 PFU/ml.
Næste gang skal vi se på, hvordan plakatanalysen kan bruges til at fremstille klonale virusoplag, et trin, der er vigtigt for at studere viral genetik.
Dulbecco, R., & Vogt, M. (1953). Nogle problemer inden for dyrevirologi som undersøgt ved hjælp af plaque-teknikken. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 18, 273-279