Metabolic engineering af Escherichia coli til produktion af cinnamaldehyd

Selektion af enzymer til biosyntese af cinnamaldehyd

Cinnamaldehyd kan syntetiseres fra l-phenylalanin, og biosyntesen kræver tre enzymatiske reaktioner: (i) deaminering af l-p-fenylalanin til cinnaminsyre af phenylalanin-ammoniaklyase (PAL, EC 4.3.1.24), (ii) syre-thiol-ligering af cinnaminsyre til cinnamoyl-CoA af 4-coumarat:CoA-ligase (4CL, EC 6.2.1.12) og (iii) reduktion af cinnamoyl-CoA til cinnamaldehyd ved cinnamoyl-CoA-reduktase (CCR, EC 1.2.1.44) (fig. 1a) . PAL er et allestedsnærværende enzym, der kan findes i mange planter, svampe og nogle bakterier, og det har forskellige aktiviteter og specificiteter alt efter enzymets oprindelse . Vi undersøgte to PAL-enzymer, et fra planten Arabidopsis thaliana (AtPAL) og et andet fra bakterien Streptomyces maritimus (SmPAL), for deres egnethed til at producere cinnaminsyre i E. coli. For AtPAL’s vedkommende findes der fire isomerer, herunder AtPAL1 til AtPAL4, og det er tidligere blevet rapporteret, at de fleste af dem (AtPAL1, 2 og 4) har tilsvarende højere aktiviteter end AtPAL3 over for l-phenylalanin som substrat, så vi valgte AtPAL1 som repræsentant fra plantekilden. Deres kinetiske konstanter (Km) blev rapporteret til at være henholdsvis 68 og 23 μM . Hvert His-tagged PAL-enzym blev produceret i E. coli BL21(DE3) og oprenset efter procedurer som beskrevet i “Metoder”. Begge enzymer, AtPAL1 (78 kDa) og SmPAL (56 kDa), blev oprenset med succes (Yderligere fil 1: Figur S1). Selv om ekspressionsniveauet for AtPAL1 ikke var så højt, at båndet ikke kunne ses i spor 1 og 2 af SDS-PAGE, kunne båndet af AtPAL1 tydeligt ses efter affinitetskolonnekromatografi i spor 3, hvor det koncentrerede elut blev indlæst. Den tilsvarende molaritet af hvert oprenset PAL-enzym blev inkuberet med den samme mængde l-phenylalanin (som substrat), og produktionstiteren af cinnaminsyre blev kvantificeret ved højtydende væskekromatografi (HPLC) (Additional file 2: Figur S2). Som vist i fig. 1b udviste SmPAL signifikant højere aktivitet (21 gange ved 30 °C reaktion og 27 gange ved 37 °C reaktion) end AtPAL1.

Vi undersøgte også to forskellige 4CL-enzymer, et fra Streptomyces coelicolor (ScCCL) og et andet fra A. thaliana (At4CL), for deres egnethed til at omdanne cinnaminsyre til cinnamaldehyd i E. coli. For At4CL’s vedkommende er det kendt, at der findes 14 formodede isoformer (At4CL1-At4CL14) . Blandt de 14 isoformer har At4CL1-3 lignende aktiviteter over for cinnamat, mens resten af isoformerne ikke har det . Derfor valgte vi At4CL1 som en repræsentant. Vi brugte også CCR-enzym fra A. thaliana (AtCCR1) til omdannelse af cinnamoyl-CoA til cinnamaldehyd . Hvert 4CL-enzym (At4CL1 og ScCCL ) blev testet i kombination med CCR-enzym fra A. thaliana (AtCCR). Alle enzymer blev renset med succes med høj renhed (Yderligere fil 1: Figur S1). For at sammenligne de enzymatiske aktiviteter af At4CL1 og ScCCL blev to reaktioner, (i) At4CL1 med AtCCR og (ii) ScCCL med AtCCR, fremstillet og blandet med cinnaminsyre som substrat. Efter inkubation ved 30 og 37 °C blev cinnamaldehydtiteren analyseret ved HPLC. Som det fremgår af fig. 1c, resulterede kombinationen af ScCCL og AtCCR i en højere produktionstiter af cinnamaldehyd (4,4 gange ved 30 °C reaktion og 10,4 gange ved 37 °C reaktion) end kombinationen af At4CL1 og AtCCR. På baggrund af disse resultater konstruerede vi et kanelamaldehydbiosyntese-system i E. coli som beskrevet nedenfor ved hjælp af følgende enzymer: SmPAL, ScCCL og AtCCR.

Konstruktion af cinnamaldehydbiosyntesevej i E. coli

For at producere cinnamaldehyd i E. coli blev SmPAL-, ScCCL- og AtCCR-generne klonet ind i pTrc99A i følgende rækkefølge: SmPAL, ScCCL og AtCCR (hvilket giver pHB-CAD) (fig. 2a). E. coli W3110, der bærer pHB-CAD, blev dyrket ved to forskellige temperaturer (30 og 37 °C) for at finde den optimale temperatur til cinnamaldehydproduktion. Ekspressionen af enzymer blev analyseret ved SDS-PAGE, efterfulgt af western blot-analyse som beskrevet i “Metoder”. Ved begge temperaturer blev alle enzymer udtrykt godt og var meget opløselige (fig. 2b). Selv om hvert enzym blev udtrykt på et forskelligt niveau, var ekspressionen af hvert enzym marginalt bedre ved 37 °C end ved 30 °C. Analyse af cinnamaldehydtiter produceret i kulturmediet ved hjælp af HPLC viste også, at cinnamaldehydproduktionstiteren var 4,5 gange højere ved 37 °C end ved 30 °C (fig. 2c). Vi formodede, at den højere produktion af cinnamaldehydtiter ved 37 °C var forårsaget af et øget ekspressionsniveau af alle biosyntetiske enzymer ved 37 °C, selv om disse enzymer er aktive ved 30 °C . Herefter blev alle dyrkninger til produktion af cinnamaldehyd udført ved 37 °C.

Stammeudvikling for at øge den intracellulære pulje af l-phenylalanin

For biosyntesen af cinnamaldehyd er l-phenylalanin påkrævet som en essentiel forløber . For at øge produktionen af cinnamaldehyd er det derfor ønskeligt at øge den intracellulære pulje af l-phenylalanin for at øge produktionen af cinnamaldehyd. Til dette formål har vi rationelt re-designet E. coli til at producere mere l-phenylalanin. Ved hjælp af tilgængelige metaboliske og reguleringsmæssige oplysninger som en rettesnor har vi konstrueret E. coli W3110 på følgende måde: (i) sletning af crr-genet, der koder for EIIAGlc-protein relateret til glukosespecifikt phosphoenolpyruvatphosphotransferasesystem (PTS) for at moderere substratoptagelseshastigheden, mindske metabolitoverløb og precursorberigelse, (ii) sletning af tyrR-genet for at afhjælpe den stramme regulering af TyrR-regulonet, som indeholder gener til syntese af aromatiske aminosyrer (AAA), (iii) sletning af generne trpE (anthranilatsyntase-komponent) og tyrA for at forhindre tab af kulstofstrømmen til konkurrerende veje (biosyntese af l-tryptofan og l-tyrosin), og (iv) sletning af genet pykA (pyruvatkinase A) for at berige forstadiet og afbalancere strømmen mellem vækst og l-phenylalaninproduktion (Fig. 3). På grundlag af ovenstående skema blev der udviklet fem sekventielle knockout-mutanter af E. coli W3110 (YHP01-YHP05) (tabel 1).

Først blev et glukosespecifikt phosphoenolpyruvat PTS inaktiveret ved deletion af crr-genet i E. coli W3110-stammen, hvilket gav E. coli YHP01. Selv om dette afbryder det vigtigste system til internalisering af glukose, kan YHP01 stadig vokse i definerede medier, der indeholder glukose som eneste kulstofkilde, fordi den mannose-specifikke PTS og galaktosepermease fortsat kan internalisere glukose i cytoplasmaet . Bypassing af PTS resulterer i en øget pulje af phosphoenolpyruvat (PEP), som i sidste ende letter l-phenylalaninsyntesen . Dernæst slettede vi tyrR-genet i YHP01 for at opnå YHP02-stammen. TyrR-proteinet er en regulator i TyrR-regulonet, som indeholder otte gener, der er involveret i biosyntesen af AAA . Deletion kan også øge l-phenylalaninpuljen ved at lette den stramme regulering af gener, der er forbundet med AAA-syntese. Derefter slettede vi sekventielt trpE- og tyrA-gener begyndende med YHP02-stammen, hvilket gav henholdsvis YHP03- og YHP04-stammer. I biosyntesen af AAA’er sker der en sidste forgrening, hvor chorismat kan omdannes til l-phenylalanin, l-tryptophan eller l-tyrosin af henholdsvis PheA-, TrpE- eller TyrA-enzymer . Deletioner af trpE- og tyrA-generne kan forhindre tab af kulstof til konkurrerende veje til biosyntesen af l-tryptofan og l-tyrosin. Endelig har vi slettet pykA-genet i YHP04 for at opnå YHP05-stammen. PykA-genet koder for pyruvatkinase A (PykA), som udgør det andet PEP-konsumerende trin. Ved at slette pykA-genet kan der anvendes mere PEP i shikimatvejen, og der kan derfor produceres mere l-phenylalanin . I hver stamme (YHP01-YHP05) blev deletionen af generne verificeret ved PCR og agarosegelelektroforese (Additional file 3: Figur S3).

Alle manipulerede E. coli-stammer, herunder YHP01-YHP05 og den parentale E. coli W3110, blev dyrket i rystende kolber indeholdende semi-definerede medier, og cellevækst og l-phenylalaninproduktion blev sammenlignet. Efter 48 timers dyrkning voksede alle de manipulerede stammer lidt bedre end W3110-stammen; især E. coli YHP05-stammen udviste den højeste celletæthed (fig. 4a). I en tidligere undersøgelse blev det også observeret, at inaktivering af PTS- og Pyk-isozymerne øgede kulstofstrømmen til biomassedannelse på grund af effekten af bevarelse af reducerede mængder af intermediære metabolitter som følge af nedsat glucoseoptagelse og katabolisme . Vi analyserede også produktionstiteren af l-phenylalanin i kulturens supernatant ved hjælp af HPLC. I den oprindelige W3110-stamme var produktionstiteren af l-phenylalanin 0,24 g/L, men titerne af l-phenylalanin blev gradvist øget i de manipulerede E. coli-stammer (Fig. 4a). E. coli YHP05, hvor crr-, tyrR-, trpE-, tyrA- og pykA-generne blev slettet, udviste den højeste l-fenylalaninproduktionstiter (0,52 g/L), som var 2,2 gange højere end forældrestammen E. coli W3110. Derfor besluttede vi at bruge E. coli YHP05-stammen til yderligere engineering.

Plasmidbaseret overekspressionssystem til forøgelse af den intracellulære pulje af l-phenylalanin

Med udgangspunkt i E. coli YHP05-stammen blev produktionen af l-phenylalanin yderligere forbedret ved plasmidbaseret genoverekspression. Feedback-hæmningen i l-phenylalaninsyntesevejen af shikimat og l-phenylalanin blev reduceret ved overekspression af isozymer eller ved at indføre mutationer i enzymer involveret i shikimatvejen på følgende måde: (i) overekspression af 3-deoxy-d-arabinoheptulosonat 7-fosfat (DAHP)-syntase-genet, som er kodet i aroG med teknik (AroG8/15), (ii) overekspression af ydiB- og aroK-generne, som koder for shikimatdehydrogenase og shikimatkinase, for at øge kulstofstrømmen til shikimatvejen, (iii) overekspression af pheA-genet, der koder for CHA-mutase/præfenatdehydratase med teknik til forbedring af substratbindingsaffiniteten (PheAfbr, dm), og iv) overekspression af galP- (galactosepermease) og glk- (glucokinase) generne for at lette glucoseoptagelsen (Additional file 4: Figur S4).

Først blev plasmidet pTac15kG konstrueret for at afhjælpe feedbackhæmning, som indeholdt det manipulerede aroG8/15-gen. AroG er det vigtigste enzym, der er involveret i syntesen af DAHP, men AroG er fuldstændig hæmmet af l-phenylalanin (så lavt som 0,1 mM) . Det er kendt, at indførelsen af to mutationer (D146N og A202T) resulterede i resistens over for feedback-hæmning uden at påvirke dets høje specifikke aktivitet (AroG8/15) , så vi overeksprimerede dette mutante AroG8/15-enzym. Dernæst blev der konstrueret to plasmider (pTac15kGB og pTac15kGBK) til overekspression af henholdsvis ydiB- og aroK-generne sammen med aroG8/15-genet. Metabolisk flux til shikimatvejen kan øges, når shikimatdehydrogenase (YdiB) og shikimatkinase (AroK) overeksprimeres . Der blev også efterfølgende konstrueret et pTac15kGBKA-plasmid til overekspression af pheA-genet, som koder for chorismatmutase/præfenatdehydratase med mutationer. I denne konstruktion amplificerede vi kun de første 300 aminosyrer af wild-type PheA (PheAfbr), som udelukker det regulatoriske domæne; derfor påvirkes PheAfbr svagt af feedbackinhibering. Da PheAfbr desuden har en højere Km-værdi end wild-type PheA, hvilket afspejler dens nedsatte bindingsaffinitet til substratet , indførte vi to mutationer (E159A og E232A) i PheAfbr for at øge dens substratbindingsaffinitet, hvilket giver PheAfbr, dm . Endelig blev pYHP-plasmidet konstrueret for at overeksprimere galP- og glk-generne yderligere, som koder for henholdsvis galactosepermease og glucokinase. Begge enzymer letter glukoseoptagelsen .

Efter konstruktion af fem plasmider, herunder pTac15kG, pTac15kGB, pTac15kGBK, pTac15kGBK, pTac15kGBKA og pYHP (tabel 1), blev hvert plasmid transformeret i E. coli YHP05. Efter dyrkning i 48 timer i rystende kolber indeholdende semi-definerede medier blev cellevæksten og produktionstiteren af l-phenylalanin analyseret. Alle celler voksede godt, og især E. coli YHP05 med pYHP voksede til en marginalt højere celletæthed (OD600 = 9,76) end de andre celler (fig. 4b). Vi analyserede også produktionstiteren af l-phenylalanin i kultursupernatanten ved hjælp af HPLC. Overekspression af aroG8/15-genet (pTac15kG) resulterede i en betydelig stigning i produktionen af l-phenylalanin (2,25 g/L) sammenlignet med YHP05, der ikke har noget plasmid (0,52 g/L) (Fig. 4b). Efterfølgende overekspression af andre gener resulterede i en seriel stigning i produktionstiteren af l-phenylalanin, og E. coli YHP05, der bærer pYHP, udviste den højeste produktionstiter af l-phenylalanin (3,91 g/L) (fig. 4b). Effekten af pYHP-plasmidet resulterede i en signifikant stigning i produktionen af l-phenylalanin på henholdsvis 16,4 gange og 7,5 gange . Ved dyrkning af E. coli YHP05, der har pYHP, var l-fenylalaninudbyttet på glukose og produktiviteten henholdsvis 0,270 g/g og 0,082 g/L/h (Additional file 5: Figur S5). I den manipulerede E. coli YHP05, der har pYHP, blev puljen af l-phenylalanin således forbedret betydeligt. Liu et al. har tidligere rapporteret om produktion af l-phenylalanin i E. coli så højt som 47 g/L . Denne rekord kunne imidlertid opnås ved fed-batch-dyrkning (15 L skala), og de anvendte co-ekspression af l-fenylalanin-transporter (YddG) til effektiv produktion af l-fenylalanin i kulturmediet. I vores arbejde indførte vi ikke YddG, fordi det endelige mål med vores arbejde ikke var produktion af l-phenylalanin, men produktion af cinnamaldehyd. Selv om den titer af l-phenylalanin, der blev opnået i vores arbejde, ikke var den højeste rekord, mente vi, at den var tilstrækkelig høj til produktion af cinnamaldehyd. Derfor besluttede vi at bruge denne manipulerede stamme til produktion af cinnamaldehyd.

Cinnamaldehydproduktion i den manipulerede E. coli

Ved hjælp af den manipulerede E. coli YHP05, der bærer pYHP, undersøgte vi først produktionen af cinnaminsyre. Til dette forsøg blev plasmidet pHB-CA, som indeholder SmPAL-genet under IPTG-inducerbar trc-promotor, konstrueret (tabel 1). E. coli YHP05 med både pHB-CA og pYHP blev dyrket i kolber i 48 timer, og produktionstiteren af cinnaminsyre blev analyseret. E. coli YHP05 og E. coli W3110, der bærer pHB-CA (uden pYHP), blev også undersøgt som kontrol. Vækstmønstre for alle cellerne var ens (fig. 5a), og E. coli W3110 og YHP05 med pHB-CA producerede henholdsvis 79 og 108 mg/L cinnaminsyre (fig. 5b). E. coli YHP05 med både pHB-CA og pYHP udviste en betydeligt bedre produktionstiter (287 mg/L), som var 3,6 gange og 2,7 gange højere end for E. coli W3110 og YHP05 med henholdsvis pHB-CA (fig. 5b). Så vidt vi ved, var denne produktionstiter også 1,5 gange højere end det højeste niveau (186 mg/L), der er rapporteret i E. coli . Dette resultat viser klart, at forhøjelsen af mængden af l-phenylalanin i den manipulerede E. coli-stamme bidrager positivt til at øge produktionen af cinnaminsyre.

Som et hovedmål undersøgte vi cinnamaldehydproduktionen i den manipulerede E. coli YHP05-stamme, som blev transformeret med pHB-CAD og pYHP. Desuden blev E. coli YHP05 og E. coli W3110, der har pHB-CAD (uden pYHP), undersøgt som kontroller. Cellevæksten var ens (fig. 6a), og de tre cinnamaldehyd-biosyntetiske enzymer blev udtrykt godt i alle undersøgte celler (Additional file 6: Figur S6). Efter kultivering i kolbe i 48 timer blev kultursupernatanterne opsamlet, og produktionstiterne af cinnamaldehyd blev bestemt ved HPLC. E. coli W3110 (pHB-CAD) og E. coli YHP05 (pHB-CAD) udviste kanelamaldehydproduktionstiter så høje som henholdsvis 2,18 og 6,3 mg/L (fig. 6b). Tværtimod udviste E. coli YHP05 (pHB-CAD og pYHP) en betydeligt højere produktionstiter (75 mg/L), som var 35 gange højere end E. coli W3110 (pHB-CAD).

Nematicid aktivitet af cinnamaldehyd produceret af manipuleret E. coli

For at evaluere den nematicide aktivitet af cinnamaldehyd produceret i kulturmedium blev nematoder, B. xylophilus, behandlet med cinnamaldehyd efter procedurer som beskrevet i “Metoder” . Kulturoverskuddet af E. coli YHP05 med pYHP og pHB-CAD blev fortyndet, indtil den endelige koncentration af cinnamaldehyd var 60 mg/L, og nematoderne blev behandlet med det fortyndede kulturoverskud. Efter 1 og 4 timer overlevede kun henholdsvis 26 % og under 18 % af nematoderne (fig. 7). Som en positiv kontrol blev nematoderne behandlet med kommercielt tilgængelig og renset cinnamaldehyd i en tilsvarende koncentration (60 mg/L). Efter 4 timer var næsten alle nematoder (95 %) dræbt. Disse resultater viste, at de nematicide aktiviteter var ens mellem den kommercielt købte cinnamaldehyd og den fremstillede cinnamaldehyd i denne undersøgelse. Som en negativ kontrol blev kulturovernatanten af E. coli W3110 også testet, og som forventet overlevede næsten alle nematoder (>92 %) efter 4 h.