Isotopfraktionering, berigelse af en isotop i forhold til en anden isotop i en kemisk eller fysisk proces. To isotoper af et grundstof er forskellige i vægt, men ikke i bruttokemiske egenskaber, som bestemmes af antallet af elektroner. Der er dog subtile kemiske virkninger som følge af forskellen i isotopers masse. Isotoper af et grundstof kan have lidt forskellige ligevægtskonstanter for en bestemt kemisk reaktion, således at der dannes lidt forskellige mængder af reaktionsprodukter af reaktanter, der indeholder forskellige isotoper. Dette fører til isotopfraktionering, hvis omfang kan udtrykkes ved en fraktionsfaktor, alfa (α), også kendt som en separationsfaktor eller berigelsesfaktor. Denne faktor er forholdet mellem koncentrationerne af de to isotoper i den ene forbindelse divideret med forholdet i den anden forbindelse. Hvis Nl og Nh står for de relative hyppigheder af henholdsvis de lette og tunge isotoper i den oprindelige forbindelse, og hvis nl og nh er de tilsvarende hyppigheder i den nye forbindelse, så er α = (Nl/Nh)/(nl/nh). Fraktioneringsfaktoren er den faktor, hvormed to isotopers abundansforhold vil ændre sig under en kemisk reaktion eller en fysisk proces.
Fældningen af kalciumkarbonat fra vand er et eksempel på en ligevægtsfraktioneringsproces. Under denne udfældning er oxygen-18 beriget med en faktor på 2,5 procent i forhold til den lettere, mere almindelige isotop oxygen-16. Fraktioneringsfaktoren afhænger af temperaturen og kan derfor bruges som et middel til at bestemme temperaturen i det vand, hvori udfældningen finder sted. Dette er grundlaget for det såkaldte iltisotop-geotermometer.
Under fotosynteseprocessen beriges kulstof-12, den mest almindelige isotop af kulstof, yderligere i forhold til den tungere isotop, kulstof-13; cellulose og lignin i træ fra træer beriges med en faktor på omkring 2,5 procent under denne proces. Fraktioneringen er i dette tilfælde ikke en ligevægtsproces, men snarere en kinetisk effekt: den lettere isotop går hurtigere gennem fotosynteseprocessen og bliver derfor beriget.
Fysiske processer, såsom fordampning og kondensation og termisk diffusion, kan også resultere i en betydelig fraktionering. For eksempel er oxygen-16 beriget i forhold til de tungere oxygenisotoper i vand, der fordamper fra havet. På den anden side er enhver udfældning beriget i den tunge isotop, hvilket resulterer i en yderligere koncentration af oxygen-16 i atmosfærisk vanddamp. Da fordampnings- og kondensationsprocesserne har tendens til at foregå i henholdsvis ækvatorområderne og polarområderne, er sne i polarområderne nu ca. 5 % fattigere på oxygen-18 i forhold til det omgivende hav. Da forholdet mellem iltisotoper i nedfaldsstoffer er følsomt over for små ændringer i temperaturen på aflejringstidspunktet, er målinger af polare iskerner nyttige til undersøgelse af klimaændringer.
Den fissile isotop uran-235 er blevet adskilt fra den mere rigelige, ikke-fissile isotop uran-238 ved at udnytte den lille forskel i de hastigheder, hvormed de gasformige hexafluorider af de to isotoper passerer gennem en porøs barriere.