GFP
Grønt fluorescerende protein (GFP) er et enkelt polypeptid-genprodukt på 238 aminosyrer, der blev opdaget i vandmanden Aequorea victoria. Proteinet har en naturlig grøn fluorescens under specifikke belysningsforhold. Proteinet får sin bioluminescens fra Ser-Tyr-Gly-cyklisering i sin primære aminosyresekvens. GFP er ret stabilt og tåler en række kemiske behandlinger og procedurer.1 Den første demonstration af, at dette fluorescerende protein kunne udtrykkes i et heterologt system, fandt sted i C. elegans.2 GFP er siden da blevet et yndet reportergen, fordi det ikke kræver biokemisk transformation, kontraststof eller brug af skadelig ioniserende stråling for at blive visualiseret.3 Siden den første rapport er der blevet rapporteret om GFP-reportergenekspression i flere organismer, herunder mus.4 Desuden kan transgene GFP-mus under ledelse af en specifik promotor udtrykke det fluorescerende protein på en vævs- og endda cellespecifik måde. Den ikke-invasive visualisering er nøglen til at kunne overvåge fysiologiske og biokemiske processer in vivo og i realtid.5
Der er mange måder at visualisere GFP’s bioluminescens på. En måde at detektere fluorescensen på er med et håndholdt UV-lys (365 nM). Der er flere modeller, der tilbydes af Fisher i et prisinterval på ca. 100 til 200 dollars. Den håndholdte UV-lysmetode fungerer ikke særlig godt for den transgene GFPX-stamme (Stock 003116). Dr. Andras Nagy, der er donor af GFPX- og GFPU-transgenerne (Stock 003115 og 003116), beskriver et headset til visning og et filter, der kan tilpasses til mikroskopet, og som nu er tilgængelige i handelen.
CFP og YFP
Den seneste udvikling har forbedret egenskaberne og anvendeligheden af GFP som reportergen. Enhanced GFP (EGFP) er blevet konstrueret til at blive udtrykt i højere niveauer i pattedyrceller og til at fluorescere mere intensivt. Cyan Fluorescerende Protein (CFP) og Yellow Fluorescent Protein (YFP) er spektrale varianter af GFP, der gør det muligt at mærke flere celletyper samtidigt.
Cubitt AB, Heim R, Adams SR, Boyd AE, Gross LA, Tsien RY. 1995. Forståelse, forbedring og anvendelse af grønne fluorescerende proteiner. Trends Biochem Sci 20:448-55.
Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC. 1994. Grønt fluorescerende protein som en markør for genekspression. Science 263:802-5.
Hoffman RM. 2002. Afbildning af tumorceller i mus med grønt fluorescerende protein. Lab Animal 31(4): 34-41.
Okabe M, Ikawa M, Kominami K, Nakanishi T, Nishimune Y. 1997. “Grønne mus” som en kilde til allestedsnærværende grønne celler. FEBS Lett 407:313-9.
Yang M, Baranov E, Jiang P, Sun FX, Li XM, Li L, Hasegawa S, Bouvet M, Al-Tuwaijri M, Chishima T, Shimada H, Moossa AR, Penman S, Hoffman RM. 2000. Helkropsoptisk billeddannelse af grøn fluorescerende proteinudtrykkende tumorer og metastaser. Proc Natl Acad Sci USA 97:1206-11.
lacZ
Anvendelsen af et reportergen kan gøre det muligt at undersøge rumlige mønstre for genekspression af en bestemt promotor i et væv, et embryo eller en voksen mus.1 E. coli lacZ-genet kan, når det integreres i musens genom ved transgene teknikker, anvendes som et reportergen under kontrol af en given promotor/enhancer i en transgenekspressionskassette. LacZ-genet koder for beta-galactosidase, som katalyserer spaltningen af lactose til galactose og glucose. Beta-galactosidaseaktivitet kan identificeres ved både in situ- og in vitro-teknikker ved inkubation med beta-galactosidasesubstratet X-gal. Beta-galactosidase spalter X-gal, et kromogent substrat, hvilket resulterer i et uopløseligt blåt farvestof og dermed gør det muligt at identificere celler med lacZ-aktivitet.2 Transgene dyr kan derefter anvendes til at identificere faktorer og betingelser, der modulerer promotorens eller enhancerens ekspressionsprofil.