Simultan dannelse af glykosyleringsprodukter
Dannelsen af nukleosid- og nukleotidstrukturer fra simple prækursorer blev opnået samtidig med tre nukleobaser ved dehydreringsreaktioner. Dette står i modsætning til tidligere arbejde på dette område, hvor betingelserne blev optimeret for at favorisere specifikke produkter24,25,26. I et typisk glykosyleringsforsøg blev adenin og P-ribose opvarmet ved 90 °C i 5 timer ved pH 2,5. Vi observerede dannelsen af adeninmonofosfat (AMP)-nukleotid (og dets isomerer), når adenin og P-ribose blev kombineret. De ekstraherede ionkromatogrammer (EIC’er), der er fremkommet ved HPLC-MS analyse af produkterne, afslørede flere toppe med m/z matching + og + (supplerende figurer 13-15). Sammenligning med standarder bekræftede, at AMP svarer til den top, der blev fundet ved RT = 4,2 min (supplerende figurer 5 og 6); andre større toppe kan være i overensstemmelse med AMP-isomerer, såsom den N6-ribosylerede isomer. For at bekræfte dette blev der udført en hydrolysereaktion i nærværelse af NaOH (0,1 M) i et forsøg på at skelne mellem de forskellige isomerer, idet den N6-ribosylerede isomer er mere tilbøjelig til at blive hydrolyseret. Der kan imidlertid observeres en lille forstyrrelse i toppene, hvilket gør det vanskeligt at bekræfte identiteten af den N6-ribosylerede isomer. Derefter analyserede vi to rene standarder for to forskellige isomerer (adenosin 3′-monofosfat og adenosin 5′-monofosfatmonohydrat) hver for sig og i en blanding for at belyse isomerernes elueringsprofil (supplerende figur 148 og 149). Der kan observeres en forskydning i retentionstiden for standardblandingen, hvilket giver en bedre korrelation med elutionen af disse forbindelser i den virkelige prøve. Selv om det er vanskeligt at skelne mellem isomerer, kan vi bekræfte tilstedeværelsen af mindst to isomerer i AMP-produkterne ved at sammenligne elueringsprofilen for standardblandingen med den reelle prøve. Det er nu klart, at dannelsen af forskellige isomerer (supplerende fig. 12) er en mulig årsag til eluering af nukleotider med samme masse ved forskellige retentionstider. Desuden afslører MS/MS-analyse af vores reaktionsprodukter fragmentering af AMP (og dets isomerer) til adenin (m/z = 136,0617 ± 0,01) (Supplerende fig. 20); dette er i overensstemmelse med fragmentering af den kanoniske AMP-standard. Vores foreslåede reaktionsmekanisme består af dannelsen af en glykosidisk binding mellem en 1′-OH-gruppe af ribose og en aminogruppe af adenin (se supplerende fig. 12).
Tidsforløbsreaktioner viser, at vandfordampning er den vigtigste drivkraft for dannelsen af glykosyleringsprodukter, idet der ses en betydelig stigning i dannelsen af nukleosid- og nukleotidstrukturer i tidsrummet mellem 2 og 4 timer (fig. 2a). Dette svarer til det tidsinterval, hvor prøvevolumenet er drastisk reduceret, og reagenserne er ekstremt koncentrerede. Efter 5-6 timers reaktion når prøven tørhed, og reaktionshastigheden (efterfulgt af intensiteten i HPLC-MS-målingerne) stabiliseres. Ud over AMP blev glykosidbindingsholdige produkter, herunder cykliske nukleotider (dvs. cAMP)27 og nukleosider (dvs. adenosin), påvist ved hjælp af RP-HPLC-MS, MS/MS og testet for dannelse af 1,N6-ethenoderivater28,29 , hvilket blev bekræftet ved sammenligning med standarder (fig. 2, supplerende figurer 7-11, supplerende figurer 23-27). Retentionstiderne for 2′,3′-cAMP og 3′,5′-cAMP-kanoniske standarder svarede ikke til retentionstiderne for EIC-toppene i prøven. Massefordelingerne (+; +) og fragmenteringsmønstrene (+) var imidlertid identiske (supplerende figurer 16-21). Disse resultater viser, at selv om der dannes cykliske strukturer, er det kanoniske cAMP ikke det vigtigste produkt. Sammenligning med en adenosin-analytisk standard viser også, at adenosin sammen med en række isomere arter dannes i kondensationsreaktionen mellem P-ribose og adenin (supplerende figurer 18-22). Mens de kanoniske former af AMP og adenosin blev bekræftet i disse eksperimenter, var de ikke hovedprodukterne i dehydreringsreaktionen.
Adeninnukleotidprodukter. Tidsforløb af en reaktion af P-ribose med adenin ved 90 °C; produkterne blev analyseret ved RP-HPLC-MS. a Repræsentation af de samlede topområder i det ekstraherede ion-kromatogram (EIC) for masserne af adeninglykosyleringsprodukter. b EIC’er for adeninglykosyleringsprodukter over tid. Hvert datapunkt repræsenterer gennemsnittet af tre gentagelser ± standardafvigelse
Når fosfat blev tilført separat som pyrofosfat og reagerede med adenin og ribose, blev der påvist en forbindelse med massen af adenosin, og der blev påvist en lav mængde AMP og cAMP, og der blev stadig dannet adenosin, når der ikke var nogen fosfatkilde til stede (supplerende fig. 33-41). Det er værd at bemærke, at vi med vilje har fokuseret vores undersøgelser på at identificere fosforylerede produkter (AMP-isomerer og cAMP-isomerer) og har lagt mindre vægt på at identificere fosforylerede produkter, der ikke er AMP-isomerer og cAMP-isomerer30,31,32. Vi foreslår dannelsen af en glykosidisk binding mellem hydroxylgruppen i ribose og en aminogruppe i adenin, som udløses af tabet af et vandmolekyle ved fordampning. Den relative reaktivitet af de primære og sekundære aminogrupper i adenin er velundersøgt33 , og uden aktivering eller tilstedeværelse af en beskyttelsesgruppe er glykosidisk binding ved den primære amin normalt at foretrække. Derfor forventes den kanoniske isomer af adenosin/AMP ikke at være et hovedprodukt, da det udelukkende ville kræve reaktion ved den sekundære amin. Reaktiviteten er imidlertid tilstrækkelig høj på det sekundære aminsted til, at de kanoniske isomerer kan dannes, om end ikke som det vigtigste produkt. I andre nukleobaser, f.eks. guanin, er der endnu flere tilgængelige amingrupper, og potentialet for isomere produkter er større. Reaktiviteten af ribose er sandsynligvis overvejende gennem den anomeriske position, hvilket fører til færre mulige isomerer, selv om der kan observeres nogle andre mindre produkter.
Reaktiviteten af andre kanoniske nukleobaser (cytosin, guanin og thymin) med P-ribose blev også undersøgt. Der blev påvist masser svarende til nukleosid- og nukleotidstrukturer efter dehydreringsreaktionen af guanin og cytosin med P-ribose (fig. 3 og supplerende figurer 50-64). Guanin-glykosyleringsstrukturer blev dannet i relativt lavt omfang, sandsynligvis på grund af guanins begrænsede opløselighed ved lav pH. De målte produktmængder for 5-methyluridinmonofosfat (m5UMP) og 5-methyluridin (thymin-nukleosid) var endnu lavere end deres ækvivalenter fra guanin og cytosin (fig. 3 og supplerende figurer 65, 66). Disse resultater kan forklares med tilstedeværelsen af en primær aminogruppe i guanin og cytosin, som mangler i thymin. Mens alle tre nukleobaser har sekundære aminogrupper, er disse mindre reaktive ved dannelse af glykosidiske bindinger. Derfor er dannelsen af nukleosid- og nukleotidstrukturer gennem en sekundær aminreaktion, som er nødvendig for at danne kanoniske glykosyleringsprodukter, ugunstigt stillet i nukleobaser, hvor der findes primære aminer. Dette har en interessant implikation for vedtagelsen af nukleinsyrekemi i livets oprindelse, da det tyder på, at de kanoniske nukleotider i første omgang kan have været uegnede, indtil der var opstået yderligere biokemisk maskineri til at øge selektiviteten i retning af de korrekte isomerer. Derfor blev der som forventet dannet kanoniske nukleotid- og nukleosidprodukter af cytosin og guanin i vores eksperimenter, men de svarede ikke til de vigtigste observerede toppe (Supplerende figurer 42-49). Ved at kombinere disse to observationer (forskellige retentionstider, men samme massefordeling som de kanoniske standarder i EIC’erne) kan vi konkludere, at de nukleotid- og nukleosidarter, der blev dannet fra dehydreringsreaktionen af guanin/cytosin med P-ribose, hovedsagelig var isomere arter af de kanoniske nukleotider og nukleosider (nogle mulige strukturer er vist i supplerende figurer (se fig. 50, 51).
Andre produkter fra P-ribose og nukleobase. Alle vandige reaktionsblandinger bestående af 25 mM P-ribose + 25 mM nucleobase blev opvarmet ved 90 °C i 5 timer, og produkterne blev analyseret ved RP-HPLC-MS. Repræsentation af de samlede peakområder i EIC for masserne af cytosin-, guanin- og thymin-glykosyleringsprodukter
Typisk er dannelsen af nukleotidstrukturer blevet udført under specifikke betingelser afhængigt af den anvendte nukleobase, der er målrettet mod et specifikt reaktionsprodukt. I en alternativ tilgang besluttede vi at inkludere flere nukleobaser samtidig i reaktionen med P-ribose. Vores mål var at afgøre, om produktdannelsen med flere nukleobaser under de samme reaktionsbetingelser ville give en blanding af produkter eller blive domineret af et enkelt produkt. Denne reaktion blev udført ved at inkludere to eller tre nukleobaser (adenin, guanin og cytosin) samtidig i reaktionsbeholderen sammen med P-ribose. Der fremkom en blanding af glykosyleringsprodukter, som omfattede nukleotider (AMP, GMP og CMP) samt de respektive cykliske nukleotid- (cAMP, cGMP og cCMP) og nukleosidprodukter (adenosin, guanosin og cytidin) (supplerende fig. 67-95). Guanin-glykosyleringsprodukter blev dannet i et lavere udbytte end dem af adenin og cytosin, som forventet på grund af guanins lave opløselighed under sure forhold.
Nucleobaseudveksling
Nucleobaseudveksling blev observeret, når Na+AMP blev opvarmet i 5 timer ved 90 °C i sure vandige medier med cytosin eller guanin i 5 timer ved 90 °C. Nukleobaseudveksling resulterede i dannelse af nukleotid- (CMP eller GMP), cykliske nukleotid- (cCMP eller cGMP) og nukleosid- (cytidin eller guanosin) strukturer (se supplerende figurer 96-102 og supplerende tabel 1 for semikvantitative udbytter). I dette forsøg viste CMP og cytidin en stigende tendens i intensitet, mens cCMP nåede en maksimal intensitet ved 12,5 mM og derefter faldt indtil en intensitet på 4,0 × 104 AU (supplerende fig. 102a og 155-158). Ved en cytosinkoncentration på 37,5 mM viste det sig, at forbindelsen med den højeste intensitet var CMP, og de målte intensiteter for cCMP og cytidin var næsten de samme. Der blev observeret to isomere hovedarter i EIC’erne for CMP og cCMP. Der blev påvist +, + og +-masser for CMP, mens cCMP viste +, + og + inden for deres respektive massefordelinger. For cytidin var + den vigtigste påviste top. Disse massefordelinger stemte overens med dem, der blev observeret i standarderne. Retentionstiden for de vigtigste isomerer svarede imidlertid ikke til den kanoniske CMP og cytidin. Når AMP blev reageret med stigende koncentrationer af guanin (supplerende figur 102b), nåede alle tre glykosyleringsprodukter (GMP, cGMP og guanosin) en maksimal værdi, når koncentrationen af guanin var 2,5 mM (supplerende figurer 160-162). Disse resultater var en konsekvens af den begrænsede opløselighed af guanin ved sur pH, således at selv om der blev tilsat mere guanin til reaktionsbeholderen, var den effektive koncentration i opløsningen den samme. Efter den maksimale værdi var intensiteten af cGMP og guanosin konstant, hvilket skyldtes guanins ringe opløselighed. Der blev kun observeret en lille stigning i intensiteten af alle tre guanin-glykosyleringsprodukter ved = 37,5 mM, hvilket kan være relateret til en større tilstedeværelse af guanin i opløsningen på grund af den høje koncentration, der blev tilsat. I EIC for GMP blev der observeret et bredt område uden veldefinerede toppe, selv om to hovedtoppe skilte sig ud. + var den eneste kemiske art, der var relateret til guaninforbindelser, og som blev påvist i massefordelingen på dens EIC. Fire toppe, grupperet i par, blev observeret, da cGMP’s EIC blev ekstraheret fra MS-dataene, og massefordelingen viste +- og +-arter. På den anden side viste EIC af guanosin tre toppe, hvoraf den mest intense viste tilstedeværelsen af + i dens massefordeling.
Dannelsen af cytosin- og guanin-glykosyleringsprodukter viste, at spaltning af AMP-glykosidbindingen fandt sted under vores reaktionsbetingelser. Da EIC’erne af AMP, cAMP og adenosin blev analyseret, blev der observeret flere toppe i hvert kromatogram, hvilket understøtter teorien om, at glykosidiske bindinger undergår dynamisk hydrolyse/dannelse under dehydreringsreaktionen34. Reaktioner af cytosin- og guaninnukleotider med adenin blev også undersøgt. I forbindelse med dehydreringsreaktionen mellem CMP og adenin kunne der ikke observeres nogen produkter svarende til nukleobaseudveksling (supplerende figur 103-108/a). Derimod blev der tydeligt påvist adeninglykosyleringsprodukter ved reaktionen mellem GMP og adenin (supplerende figur 105-108/b). Dette skyldes, at hydrolysen af glykosidbindinger i GMP er lettere end for CMP under de samme reaktionsbetingelser34. Vi har også udført nukleobaseudvekslingsreaktionen med UMP og adenin for at sammenligne den med den direkte pyrimidinanalog af adenin (supplerende figur 109). Resultaterne lignede mere CMP-udbytterne vist i supplerende fig. 108 end GMP-udbytterne, idet vi opnåede et meget lavt udbytte for adenin-glykosyleringsprodukterne i UMP-reaktionen, som ikke er tilstrækkeligt til at muliggøre påvisning af AMP og cAMP.
Aminosyrers virkning på glykosyleringsprodukternes fordeling
Som tidligere nævnt kan aminosyrer, nukleotider og deres byggesten have været til stede på den tidlige Jord på samme tid. Derfor kunne produkter af en co-polymeriseringsreaktion eller endog produkter, der skyldes en vis katalytisk virkning af den ene type polymer i forhold til den anden, være opstået i et præbiotisk miljø. For at undersøge samreaktiviteten af nukleotidbygningsblokke og aminosyrer i en one-pot dehydrering blev glycin, den enkleste aminosyre, inddraget i dehydreringsreaktionerne af P-ribose og de respektive nukleobaser. Indarbejdelsen af glycin havde en klar virkning på dannelsen af glykosyleringsprodukter, idet det samlede udbytte af produkter med masse af AMP-isomerer, cAMP-isomerer og adenosin (fig. 4a og supplerende fig. 28-32) faldt. Dette tyder på, at glycin spiller en rolle ved enten at forbruge nukleotidbygningsblokke (P-ribose og/eller adenin) gennem en bivirkningsreaktion, eller at det bliver bundet til produktstrukturen og ændrer dens masse. EIC-analyse for disse reaktioner afslører toppe, der svarer til massen af glycinaddukter (dvs. AMP-Gly, cAMP-Gly, adenosin-Gly og adenin-Gly) (Supplerende figurer 115-122), selv om disse sideprodukter ikke dannes i tilstrækkelig mængde til at kunne forklare alle de observerede ændringer. Glycinaddukter blev også bekræftet ved at bruge deutereret glycin som udgangsmateriale sammen med P-ribose og adenin, hvilket forårsagede ændringer i den isotopiske fordeling af adduktmasserne (Supplerende figurer 123 og 124). Der blev opnået et maksimalt semikvantitativt udbytte på 59 % for dannelsen af glykosyleringsprodukter (AMP-isomerer, cykliske AMP-isomerer og adenosin) ved reaktionen af P-ribose og adenin; derimod blev der kun opnået et udbytte på 46 %, når glycin også var til stede i reaktionsmediet (Supplerende fig. 144). Det er teknisk vanskeligt at kvantificere udbyttet for alle mulige individuelle isomerer, men det er muligt at bestemme det semikvantitative udbytte af nogle isomerer ved hjælp af rene standarder: Adenosin 5′-monofosfat og adenosin 2′,3′-cyklisk monofosfat blev fundet på henholdsvis 38,7 % og 18,2 % i fravær af glycin, mens udbyttet i tilstedeværelse af glycin blev fundet væsentligt nedsat (<2 %) for begge isomerer.
Glykosyleringsprodukter i tilstedeværelse og fravær af glycin. a Produkter af reaktionen af 25 mM P-ribose og 25 mM adenin er vist med en gennemgående linje; produkter af reaktionen af 25 mM glycin, 25 mM P-ribose og 25 mM adenin er vist med en stiplet linje. Alle reaktioner blev udført ved opvarmning af udgangsmaterialerne ved 90 °C i den angivne tid i et surt vandigt medie, hvorefter prøverne blev analyseret ved RP-HPLC-MS. b EIC for adenosinmonofosfat (m/z = 348,0683 ± 0.01) ved sammenligning af reaktionen af 25 mM adenin + 25 mM P-ribose i tilstedeværelse (rødt) og fravær (sort) af 25 mM glycin. c EIC for cyklisk guanosinmonofosfat (m/z = 346,0547 ± 0,01) ved sammenligning af reaktionen af 25 mM guanin + 25 mM P-ribose i tilstedeværelse (rødt) og fravær (sort) af 25 mM glycin. Hvert datapunkt repræsenterer gennemsnittet af tre gentagelser ± standardafvigelse
Glycin påvirkede også fordelingen af isomere arter, og der blev observeret klare forskelle i sammenligning med basistopkromatogrammet (BPC) fra reaktionen af P-ribose og adenin i tilstedeværelse og fravær af glycin (fig. 4b og supplerende fig. 110-114). Disse data indikerede tilstedeværelsen af forskellige kemiske arter og en deraf følgende ændring i massefordelingen mellem reaktionerne med og uden glycin. Individuelle EIC’er blev derefter analyseret for hvert adenin-glykosyleringsprodukt, hvilket resulterede i klare forskelle i de relative intensiteter af toppe, når der blev tilsat glycin. Disse resultater viser klart, at glycin har en selektiv virkning på, hvilke isomere arter der fortrinsvis dannes. Glycin er kendt for at reagere let med andre aminer under dehydrerende forhold12 , og det er sandsynligt, at det vil reagere med de primære aminer i nukleobaser. Hybride sideprodukter, herunder glycin (Gly-AMP, Gly-cAMP, Gly-Adenosin, Gly-Adenin) blev påvist i ~1% udbytte (Supplerende fig. 145), men denne lille procentdel har en vigtig virkning på den isomere fordeling af adeninglykosyleringsprodukterne (se Supplerende fig. 146, 147). Ændring i den isotopiske fordeling af masserne af hybridprodukterne blev påvist (Supplerende fig. 123, 124), når deutereret glycin blev inkluderet i dehydreringsreaktionen, hvilket bekræfter glycininddragelse i hybridstrukturer.
En lignende effekt på isomerfordelingen blev også observeret, når P-ribose blev reageret med cytosin/guanin i tilstedeværelse af glycin (Fig. 4c, Supplerende fig. 125-140). De maksimale intensiteter af de forskellige isomerarter faldt (GMP, CMP, cGMP, cGMP, cCMP, guanosin og cytidin), mens fordelingen af de relative intensiteter også blev påvirket. Forskellene mellem eksperimenterne blev nøje verificeret ved hjælp af en statistisk metode som f.eks. klyngeanalyse af EIC-data for at segmentere prøverne i tilstedeværelse og fravær af glycin i konstituerende grupper/klumper med fælles karakteristika (fig. 5). Formålet med klyngeanalyse i denne undersøgelse er at gruppere data (dvs. nukleotid- og nukleosidstrukturdannelse) i konstituerende sammensætninger med fælles karakteristika (f.eks. glycintilsætning versus ingen glycin). Denne analyse skal påvise en høj intern homogenitet inden for klynger/grupper og en høj ekstern heterogenitet mellem klynger/grupper. Fig. 5 viser et dendrogram med “Wards”-kobling35. For at identificere klynger i dendrogrammet har vi farvet spektrene efter tilstedeværelsen af glycin (glycin – rødt, ingen glycin – sort, tomt – blåt). Som det kan ses, klynger glycinholdige prøver sig sammen. En klynge svarer til P-ribose + adenin + glycin (tre prøver), som er adskilt fra prøver uden glycin. En anden klynge svarer til P-ribose + guanin + glycin og P-ribose + cytosin + glycin. Prøver, der indeholder adenin, adskilles i en større klynge, som adskiller sig fra de andre prøver, hvilket tyder på, at adenin har stor indflydelse på reaktionen. Der er faktisk en række andre mulige produkter og reaktioner, der kan finde sted under de udførte reaktionsbetingelser (se supplerende note 1 og supplerende fig. 150-162 for flere detaljer).
Dendrogram og basistopkromatogrammer (BPC). Der blev anvendt klyngeanalyse til at samle prøverne i konstituerende grupper med fælles karakteristika. Her viser dendrogrammet en høj intern homogenitet inden for klynger for tre gentagelser af hver af de reaktioner, der er udført i tilstedeværelse og fravær af glycin. Samtidig viser metoden en høj ekstern heterogenitet mellem klynger, hvor adeninprøverne udgør en større klynge, der er mere fjerntliggende end andre nukleotider
Andre aminosyrer blev også inkluderet i dehydreringsreaktionen af adenin med P-ribose for at teste, om de også ville have en vis effekt på den isomere fordeling af glykosyleringsprodukterne (Supplerende figur 141-143). De seks aminosyrer, der er udvalgt til denne undersøgelse (argininin, glutaminsyre, threonin, methionin, phenylalanin og tryptofan), har forskellige sidekæder med forskellige kemiske naturer og funktionelle grupper. Når resultaterne blev sammenlignet med de data, der blev opnået ved reaktionen af kun P-ribose og adenin, blev der observeret ændringer i den isomere fordeling af AMP i alle reaktionerne, undtagen for tryptofan, hvilket kan tilskrives konformationelle begrænsninger som følge af tryptofans indolbaserede sidekæde. Ved analyse af cAMP EIC’er blev der konstateret mindre ændringer i den relative intensitet af de isomere toppe. Der blev imidlertid kun observeret en klar forskel i EIC for adenosin for de reaktioner, der omfattede phenylalanin og threonin.