Hvad er immunohistokemisk (IHC) farvning?

Immunfarvning bruger antistoffer til at påvise et antigen i celler eller væv. Den største fordel ved immunfarvning i immunohistokemi (IHC) er evnen til at se det ønskede mål i en vævsprøve, samtidig med at den rumlige kontekst og vævsarkitektur bevares.

Immunohistokemi (IHC) farvning: Kort definition

Typer af farvning

Immunfarvning kan udføres enten direkte eller indirekte. Konjugering af vores applikationsvaliderede antistoffer til en række fluorophorer muliggør direkte mærkning. Klik her for at se vores tilbud om direkte konjugater.

Ofte er et direkte konjugat baseret på antigenekspressionsniveauer og tilgængelighed ikke tilstrækkeligt til at visualisere det ønskede mål. I disse tilfælde anvendes indirekte mærkning ved hjælp af et sekundært antistof. Den foretrukne metode hos CST er at anvende meget følsomme, polymerbaserede detektionsreagenser i ét trin, der er specifikke for kanin- eller mus-IgG.

Eksempler på IHC-farvning

Nedenfor er vist nogle eksempler på IHC-farvning, der er udført hos CST. Hvert af de nedenfor anvendte antistoffer har gennemgået vores strenge valideringsproces for med sikkerhed at kunne vurdere specifik detektion af det ønskede antigen.

Hvordan udføres immunohistokemisk (IHC) farvning?

Vævsforberedelse

Vævsindsamling, konservering og fikseringsprocedurer varierer afhængigt af prøven eller målet af interesse. Indsamling og fiksering af vævet påvirker direkte prøvens integritet og dine eksperimentelle resultater.

Tværbindingsfikseringsmidler, som f.eks. formalin, bruges ofte til at forberede prøver til IHC, fordi de bevarer vævets strukturelle integritet, hvilket bidrager til at bevare vævsarkitekturen. En anden mulighed er at kryokonservere (fryse) dine prøver, hvilket kan være en bedre mulighed, hvis du forsøger at påvise et fosforyleret mål.

Antigen (Epitope) Retrieval

Fixativer, der anvendes til at bevare vævsprøvens strukturelle integritet, har også ulemper, idet de kan begrave den epitop, som dit antistof er designet til at genkende.

Der findes flere metoder til at afsløre epitoper, der er blevet maskeret af fiksering. Disse omfatter proteolytisk induceret antigenretrieval, som er baseret på et enzym som proteinase K, eller varmeinduceret epitopretrieval (HIER), som bruger varme til at bryde tværbundne bindinger op og afvikle proteiner. Begge metoder kan afmaske epitoper, så de bliver tilgængelige for det primære antistof og kan farves ved IHC.

På CST er HIER den mest almindelige metode til antigenudtagning. Vores forskere afprøver imidlertid flere forskellige metoder til antigenudtagning for at bestemme de optimale betingelser for brug af hvert antistof i IHC. Den anbefalede protokol fra CST kan findes på databladet for ethvert IHC-valideret antistof.

Antistofbinding

Valg af det rigtige antistof er et af de mest kritiske trin i opnåelsen af et vellykket IHC-resultat. Alle IHC-validerede antistoffer fra CST er ikke kun verificeret som havende et stærkt signal i væv, men gennemgår også en streng valideringsprocedure for at bekræfte signalets specificitet. Vores forskere, der er specialiseret i IHC, tester et stort antal antistoffer og anbefaler kun dem, der er bedst egnet til applikationen.

Klik her for at gennemse IHC-validerede antistoffer til dit mål.

Detektionssystemer

Immunohistokemisk (IHC) farvning giver mulighed for 2 brede klasser af detektion: 1) kromogene og 2) fluorescerende. Til kromogen detektion anbefaler CST, at der anvendes polymerbaserede systemer, som undgår begrænsningerne ved det biotinbaserede system, samtidig med at følsomheden af assayet øges.

Prøv SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, kanin) #8114 eller SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, mus) #8125 afhængigt af værtsarten for dit primære antistof.

Kontrafarvning

Efter antistofdetektion foretrækker mange forskere at kontrafarve vævet for at visualisere den cellulære anatomi og orientere beskueren i forhold til den specifikke farvning. Hos CST bruger vi modfarvning af vores prøver med Hematoxylin #14166, som farver kernen blå. Når du vælger en modfarvning, er det vigtigt, at modfarvningen er kompatibel med dit kromogen. Hvis f.eks. modfarvefarven er for ens med kromogenfarven, vil antistofsignalet være svært at genkende.

Immunohistokemisk (IHC) farvningsprotokol

Nedenfor er en oversigt over vores anbefalede protokol, og fremhævet er de vigtigste trin til et vellykket eksperiment. CST har til formål at hjælpe dig med at forbedre din IHC-analyse ved at levere validerede antistoffer og reagenser, så du kan følge en enkel, produktspecifik protokol og opnå reproducerbare resultater med minimal optimering.

Se videoen om IHC-protokollen eller besøg vores side med valg af protokol.